一种重组禽表皮生长因子的制备方法技术

本发明专利技术属于生物制药领域，具体而言本发明专利技术利用生物信息学手段确定了禽EGF(cEGF)基因序列信息，提供了一种重组禽表皮生长因子的制备方法，该制备方法借助改造后的质粒在乳酸菌表达系统进行表达，其无需添加化学试剂进行诱导，表达效率高，且抗生素抗性水平低，有效防止了抗生素耐药性问题。了抗生素耐药性问题。了抗生素耐药性问题。

【技术实现步骤摘要】
一种重组禽表皮生长因子的制备方法


[0001]本专利技术属于生物制药领域，具体的，本专利技术涉及一种重组禽表皮生长因子的制备方法。

技术介绍

[0002]表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)属于多肽，可以从唾液腺，肾脏，乳腺，胎盘和十二指肠Brunner腺体分泌和产生的体液中分离出来，同时也与动物肠道结构和功能密切相关。肠道是体内细胞更新速度较快的组织之一，EGF是肠道内环境平衡的调节因子和营养因子，具有促进胃肠上皮细胞增殖和分化的能力和对肠细胞更新产生影响。据报道，EGF具有多种生物学功能，外源供给EGF可提升肠道中消化酶活力、抑制肠道有害菌的定植和提高肠细胞吸收营养物质的能力，从而提高饲料利用率和营养物质的消化吸收。用EGF喂饲感染肠致病性大肠杆菌的断奶仔兔，可发现在各段小肠以及结肠病原菌定居数量的减少，说明EGF通过有效缓解致病菌的定植保护肠道。研究表明，EGF可以加速上皮细胞恢复和改善胃肠道疾病，如坏死性肠炎，腹泻以及短肠综合症。目前人用EGF已被日本列入化妆品添加剂名录，在畜禽方面虽有所研究但仍未广泛应用。
[0003]目前EGF的生产主要有两种途径，一种是从组织或体液成分中分离提取(201711285671.7)，一种是利用基因重组技术获取重组EGF蛋白。后者由于技术成熟、成本低廉、工艺简单且易于规模化生产得到了广泛的发展应用。相关专利也主要集中于人用EGF以及猪EGF重组技术方面，而其他动物方面暂时没有相关记录。目前，猪EGF(pEGF)主要有两种途径获得，一是从母猪乳液中进行分离，其工艺复杂且数量相当有限，另一种是通过工程菌表达获得，目前采用生物技术表达外源性的pEGF的工程菌有大肠杆菌(单雪芹等人，202010611379.5)、芽孢杆菌(王喜亮等人，201910391304.8)、乳酸菌(钟泽民等人，2015；刘淑杰等人，2021)、毕赤酵母等(刘洁等人，202011586279.8)等。
[0004]在现有的EGF制备方法中，主要存在以下两个问题：一是目前EGF基因序列信息只有人、猪、犬等动物的较为清楚，其他动物的序列信息尚无明确记录以及相关研究的记载；二是现有用于重组表达的手段均有明显的短板，如抗生素使用量大，存在耐药性基因扩散隐患；诱导剂毒性；分离纯化操作复杂导致成本升高等。因此，迫切需要对其他动物的EGF序列信息进行开发并对EGF制备的方法进行改进，从而降低EGF的生产成本以及后续应用上的隐患。

技术实现思路

[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种重组禽表皮生长因子的制备方法，该方法借助改造后的质粒在乳酸菌表达系统进行表达，其无需添加化学试剂进行诱导，表达效率高，且抗生素抗性水平低，有效防止了抗生素耐药性问题，以解决上述现有技术中存在的缺陷。为了实现上述目的，本专利技术采用了如下的技术方案：
[0006]本专利技术的第一个方面，提供一种重组禽表皮生长因子(rcEGF)，所述rcEGF的核苷
酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0007]本专利技术的第二个方面，提供一种用于表达重组禽表皮生长因子的重组载体，其中，所述重组载体包含信号肽、锚定蛋白、氨苄抗性序列以及cEGF序列的基因片段的核苷酸序列，所述重组载体是重组乳酸菌表达载体pLL32a
‑
cEGF。
[0008]在一种实施方式中，所述信号肽、锚定蛋白、氨苄抗性序列以及cEGF序列的基因片段的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1
‑
4所示。
[0009]本专利技术的第三个方面，提供一种上述重组载体的构建方法，其中，所述方法包括如下步骤：
[0010](1)对人工合成的氨苄抗性基因序列和pMG36e质粒进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收目的条带和载体条带，用T4连接酶连接，转化至MC1061感受态细胞中，利用氨苄青霉素进行筛选，获得新质粒pLL32a；
[0011](2)对人工合成的含有信号肽、锚定蛋白以及cEGF序列的基因片段和pLL32a质粒进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收目的条带和载体条带，用T4连接酶连接，转化至MC1061感受态细胞中，利用氨苄青霉素进行筛选，获得重组质粒pLL32a
‑
cEGF。
[0012]本专利技术的第四个方面，提供一种重组禽表皮生长因子的制备方法，其中，所述方法为将上述构建的重组载体在乳酸菌中表达获得重组的EGF。
[0013]在一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌。作为一种优选方式，所述所述乳酸菌为乳酸乳球菌MG1363。
[0014]在一种实施方式中，所述方法包括如下步骤：
[0015](1)将上述构建的重组载体电转化至乳酸菌感受态细胞中，电转化结束后将带有重组质粒的乳酸乳球菌移入复苏培养基中37℃静置培养2h，然后涂布带有0.5ug/ml氨苄抗性的MRS平板，37℃恒温培养；
[0016](2)挑取平板上生长的单菌落纯培养后提取质粒，将质粒进行测序鉴定，得到重组菌；
[0017](3)将重组菌于含有0.5ug/ml氨苄的MRS液体培养基中37℃振荡培养4h，而后降低培养温度至30℃继续培养，终止发酵后离心发酵液，重悬菌体后加入适量溶菌酶裂解菌体获得所述重组禽表皮生长因子。
[0018]优选的，所述电转化条件为：12kV/cm、200Ω、25μF。
[0019]本专利技术相对于现有技术获得了如下有益的技术效果：
[0020]1.本专利技术填补了禽用重组表皮生长因子研究及应用方面的技术空白；
[0021]2.本专利技术利用改造后的乳酸菌系统表达的重组禽表皮生长因子相比其他表达系统而言，无需添加化学试剂进行诱导，表达效率高，且抗生素抗性水平低，有效防止了抗生素耐药性问题。
附图说明
[0022]附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：
[0023]图1：跨膜结构预测；
[0024]图2：二级结构预测；
[0025]图3：亚细胞定位预测；
[0026]图4：cEGF质粒双酶切鉴定；
[0027]图5：pLL32a质粒双酶切鉴定；
[0028]图6：重组菌western blot检测结果：1道为乳酸乳球菌1363
‑
空菌上清；2道为乳酸乳球菌1363
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空菌沉淀；3道为重组乳酸乳球菌1363
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上清；4道为重组乳酸乳球菌1363
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沉淀；5道为重组乳酸乳球菌1363
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灭活菌体。
具体实施方式
[0029]下面参照具体的实施例对本专利技术做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本专利技术，并不用于限定本专利技术的范围。
[0030]实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组禽表皮生长因子(rcEGF)，其特征在于，所述rcEGF的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。2.一种用于表达重组禽表皮生长因子的重组载体，其特征在于，所述重组载体包含信号肽、锚定蛋白、氨苄抗性序列以及cEGF序列的基因片段的核苷酸序列，所述重组载体是重组乳酸菌表达载体pLL32a
‑
cEGF。3.如权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述信号肽、锚定蛋白、氨苄抗性序列以及cEGF序列的基因片段的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1
‑
4所示。4.如权利要求2或3所述的重组载体的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)对人工合成的氨苄抗性基因序列和pMG36e质粒进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收目的条带和载体条带，用T4连接酶连接，转化至MC1061感受态细胞中，利用氨苄青霉素进行筛选，获得新质粒pLL32a；(2)对人工合成的含有信号肽、锚定蛋白以及cEGF序列的基因片段和pL L32a质粒进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收目的条带和载体条带，用T4连接酶连接，转化至MC1061感受态细胞中，利用氨苄青霉素进行筛...

【专利技术属性】
技术研发人员：江国托，刘艳，刘恩，单春乔，李娟，刘秋晨，于洪敏，王岩，宋惠男，徐福利，刘星，
申请(专利权)人：大连三仪动物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：