一种辅酶q10生产菌种的培养方法技术

本发明专利技术涉及一种辅酶q10生产菌种的培养方法，所述辅酶q10生产菌种的培养方法包括：培养基的制备、菌种分纯、母瓶接种、二级瓶接种和三级发酵瓶接种。本发明专利技术通过对斜面培养基、母瓶培养基、种子培养基和发酵培养基的配方改进，能够加速菌种的生长，迟缓期短，并且工业化的大批量稳定的生产菌种，能够提高菌种的辅酶生产量，生理状态稳定，保持稳定的生产能力；简化扩种工艺，更易安排发酵过程。更易安排发酵过程。更易安排发酵过程。

【技术实现步骤摘要】
一种辅酶q10生产菌种的培养方法


[0001]本专利技术属于微生物发酵
，特别涉及一种辅酶q10生产菌种的培养方法。

技术介绍

[0002]辅酶q10(2，3二甲氧基
‑5‑
甲基6癸异戊烯基苯醌，CoenzymeQ10，CoQ10)，又名泛醌，癸烯醌，广泛存在于动物、植物及微生物体内，是生物细胞呼吸链中的重要递氢体。辅酶q10是一种重要的生化药物，近年来已广泛应用于各类心脏病、糖尿病、癌症、急慢性肝炎、帕金森症等疾病治疗。此外，在治疗坏血病、十二指肠溃疡、坏死性牙周炎以及促进胰腺功能和分泌等方面也有显著效果。同时，辅酶q10还具有抗衰老作用，在化妆品和保健品领域有广泛的市场。
[0003]辅酶q10的制备方法主要有3种，即动植物组织提取、化学合成法和微生物发酵法。动植物组织提取法中动物辅酶q10含量低，而且各种化学成份复杂，并受原料和来源限制，因此产品成本高，价格昂贵，规模化生产受到了一定限制。化学合成法在技术上比较成熟，但其产物为顺反异构体的混合物，生物活性低，生产成本高，限制其工业化生产的程度。微生物发酵法由于原料廉价丰富，产物分离过程相对简单，产物为天然品，不存在异构体问题，生物活性好，易被人体吸收，且可以通过发酵罐实现规模化工业化生产，因此成为最有发展潜力的辅酶q10生产方法。
[0004]目前国内的辅酶q10的市场需求呈逐年增长之势，但是目前所使用的培养基在培养辅酶q10生产菌种时，菌种的生长速度缓慢，并且菌种在发酵过程中所生产的辅酶q10的产量也不高，已经远不能满足市场的需求。
[0005]因此，亟需提供一种辅酶q10生产菌种的培养方法，能够提高菌种的生长速度，并提高菌种生产辅酶q10的产量。

技术实现思路

[0006]针对上述问题，本专利技术提供一种辅酶q10生产菌种的培养方法，该方法能够提高菌种的生长速度，并提高菌种生产辅酶q10的产量。
[0007]一种辅酶q10生产菌种的培养方法，所述培养方法包括以下步骤：
[0008]S1、培养基的制备：
[0009]分别制备斜面培养基、母瓶培养基、种子培养基和发酵培养基；
[0010]其中，所述斜面培养基的配方为：硫酸铵2.5g/L、L
‑
谷氨酸钠1g/L、玉米浆干粉2g/L、一水硫酸锰0.03g/L、六水氯化钴0.001g/L、葡萄糖10g/L、酵母浸粉6g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、七水硫酸亚铁0.1g/L、七水硫酸镁2g/L、氯化钠2g/L、琼脂粉18g/L、纯化水和辅液I；
[0011]S2、菌种分纯：
[0012]挑起生长正常、墨绿、光滑圆润优良、直径1mm～2mm的单菌落，放入9mL无菌生理盐水进行制备菌悬液，吸取1mL进入下一支试管，分纯到6次方按0.2～0.4mL在斜面培养基上
进行平板涂布，将斜面培养基放入培养室两层纱布盖好培养，培养条件为：温度32℃，湿度45～50％，时间5～6天；
[0013]S3、母瓶接种：
[0014]挑起生长正常、墨绿、光滑圆润优良的单菌落24～36颗，接种到盛放有母瓶培养基的100mL/锥形瓶中，100mL/锥形瓶进行纱布封口传入培养室摇床，培养条件为：温度32℃，转速180r/min～220r/min，培养时间28～32h，pH6.2～6.5；
[0015]S4、二级瓶接种：
[0016]对母瓶培养基进行残糖测定，当残糖降至0～0.2g/L；菌浓OD≥7.0；湿重30～35g/L时，将母瓶培养基中的菌种按10％的量转入种子培养基中，将盛放有种子培养基的100mL/锥形瓶通过纱布包扎好，传入培养室摇床培养，培养调节为：时间18～22h，温度32℃，转速180r/min～220r/min；
[0017]S5、三级发酵瓶接种：
[0018]对种子培养基进行残糖测定，当残糖降至0～0.2g/L，菌浓OD≥17.0，湿重45g～50g/L时，培养好的母瓶菌种按20％的量转入发酵培养基，包扎好传入摇床培养室培养24h～48h下摇床检测，培养调节为：温度34℃，转速180r/min～200r/min。
[0019]进一步地，在所述步骤S1中，所述辅液I的配方为：VB10.01g/L、VB20.001g/L、VB60.00172g/L、烟酸0.0114g/L、烟酰酸0.0114g/L、叶酸0.00052g/L、泛酸钙0.0002g/L和生物素0.00036g/L。
[0020]进一步地，在所述步骤S1中，所述斜面培养基的制备方法为：称取18g/L的琼脂粉倒入三角瓶中，按比例称取：硫酸铵、L
‑
谷氨酸钠、玉米浆干粉、一水硫酸锰、六水氯化钴、葡萄糖、酵母浸粉、磷酸氢二钾、七水硫酸亚铁、七水硫酸镁和氯化钠加入适量的水进行热溶解，加入已配制好的六水氯化钴、氯化胆碱及辅液I使充分溶解，补足水量，测定其原始pH记录，混合均匀后按每三角瓶装500mL/瓶的量进行分装，塞上棉塞，包好防水纸，置于灭菌锅内以温度120～122℃，灭菌30分钟，灭菌后放洁净台冷却至50℃，无菌室洁净台制斜面培养基平板待接种用。
[0021]进一步地，在所述步骤S1中，所述母瓶培养基配方：硫酸铵2.5g/L、酵母粉1g/L、玉米浆干粉0.5g/L、味精0.5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、葡萄糖4.0g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、七水硫酸亚铁0.1g/L、七水硫酸镁2.0g/L、氯化钠2.0g/L、一水硫酸锰0.03g/L、六水氯化钴0.001g/L、氯化胆碱0.004g/L、纯化水、碳酸钙8.0g/L和辅液I；
[0022]所述母瓶培养基的制备方法为：称取硫酸铵、酵母粉、玉米浆干粉、味精、磷酸二氢钾、葡萄糖、磷酸氢二钾、七水硫酸亚铁、七水硫酸镁、氯化钠、一水硫酸锰、六水氯化钴、氯化胆碱、纯化水、碳酸钙，加热搅拌，使其溶解，最后补足水量至需要量，测定其原始pH记录，按100mL/500mL小挡板三角瓶的量进行分装，采用8层纱布包扎，外加两层纱布、一层防水纸进行包扎，取所需的辅液I装入500mL三角瓶中加1倍水进行稀释塞好棉塞包扎好，置于灭菌锅内以温度120～122℃，灭菌20分钟，在接种操作前加入稀释好的辅液I2mL/100mL。
[0023]进一步地，所述种子培养基包括一级种子培养基和二级种子培养基，在步骤S4中，
[0024]对母瓶培养基进行残糖测定，当残糖降至0～0.2g/L，菌浓OD≥7.0，湿重30～35g/L时，将母瓶培养基中的菌种按10％的量转入一级种子培养基中摇床培养，当残糖降至0～0.2g/L，菌浓OD≥10.0，湿重35～40g/L时，将一级种子培养基中的菌种按10％的量转入二
级种子培养基中摇床培养，当残糖降至0～0.2g/L，菌浓OD≥17.0，湿重45～50g/L时再进行步骤S5的操作。
[0025]进一步地，
[0026]在步骤S4中，所述一级种子培养基配方：硫酸铵2.5g/L、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种辅酶q10生产菌种的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括以下步骤：S1、培养基的制备：分别制备斜面培养基、母瓶培养基、种子培养基和发酵培养基；其中，所述斜面培养基的配方为：硫酸铵2.5g/L、L
‑
谷氨酸钠1g/L、玉米浆干粉2g/L、一水硫酸锰0.03g/L、六水氯化钴0.001g/L、葡萄糖10g/L、酵母浸粉6g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、七水硫酸亚铁0.1g/L、七水硫酸镁2g/L、氯化钠2g/L、琼脂粉18g/L、纯化水和辅液I；S2、菌种分纯：挑起直径1mm～2mm的单菌落，放入9mL无菌生理盐水进行制备菌悬液，吸取1mL进入下一支试管，分纯到6次方按0.2～0.4mL在斜面培养基上进行平板涂布，将斜面培养基放入培养室两层纱布盖好培养，培养条件为：温度32℃，湿度45～50％，时间5～6天；S3、母瓶接种：挑起的单菌落24～36颗，接种到盛放有母瓶培养基的100mL/锥形瓶中，100mL/锥形瓶进行纱布封口传入培养室摇床，培养条件为：温度32℃，转速180r/min～220r/min，培养时间28～32h，pH6.2～6.5；S4、二级瓶接种：对母瓶培养基进行残糖测定，当残糖降至0～0.2g/L；菌浓OD≥7.0；湿重30～35g/L时，将母瓶培养基中的菌种按10％的量转入种子培养基中，将盛放有种子培养基的100mL/锥形瓶通过纱布包扎好，传入培养室摇床培养，培养调节为：时间18～22h，温度32℃，转速180r/min～220r/min；S5、三级发酵瓶接种：对种子培养基进行残糖测定，当残糖降至0～0.2g/L，菌浓OD≥17.0，湿重45g～50g/L时，培养好的母瓶菌种按20％的量转入发酵培养基，包扎好传入摇床培养室培养24h～48h下摇床检测，培养调节为：温度34℃，转速180r/min～200r/min。2.根据权利要求1所述的辅酶q10生产菌种的培养方法，其特征在于，在所述步骤S1中，所述辅液I的配方为：VB10.01g/L、VB20.001g/L、VB60.00172g/L、烟酸0.0114g/L、烟酰酸0.0114g/L、叶酸0.00052g/L、泛酸钙0.0002g/L和生物素0.00036g/L。3.根据权利要求2所述的辅酶q10生产菌种的培养方法，其特征在于，在所述步骤S1中，所述斜面培养基的制备方法为：称取18g/L的琼脂粉倒入三角瓶中，按比例称取：硫酸铵、L
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谷氨酸钠、玉米浆干粉、一水硫酸锰、六水氯化钴、葡萄糖、酵母浸粉、磷酸氢二钾、七水硫酸亚铁、七水硫酸镁和氯化钠加入适量的水进行热溶解，加入已配制好的六水氯化钴、氯化胆碱及辅液I使充分溶解，补足水量，测定其原始pH记录，混合均匀后按每三角瓶装500mL/瓶的量进行分装，塞上棉塞，包好防水纸，置于灭菌锅内以温度120～122℃，灭菌30分钟，灭菌后放洁净台冷却至50℃，在无菌室洁净台制斜面培养基平板待接种用。4.根据权利要求3所述的辅酶q10生产菌种的培养方法，其特征在于，在所述步骤S1中，所述母瓶培养基配方：硫酸铵2.5g/L、酵母粉1g/L、玉米浆干粉0.5g/L、味精0.5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、葡萄糖4.0g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、七水硫酸亚铁0.1g/L、七水硫酸镁2.0g/L、氯化钠2.0g/L、一水硫酸锰0.03g/L、六水氯化钴0.001g/L、氯化胆碱
0.004g/L、纯化水、碳酸钙8.0g/L和辅液I；所述母瓶培养基的制备方法为：称取硫酸铵、酵母粉、玉米浆干粉、味精、磷酸二氢钾、葡萄糖、磷酸氢二钾、七水硫酸亚铁、七水硫酸镁、氯化钠、一水硫酸锰、六水氯化钴、氯化胆碱、纯化水、碳酸钙，加热搅拌，使其溶解，最后补足水量至需要量，测定其原始pH记录，按100mL/500mL小挡板三角瓶的量进行分装，采用8层纱布包扎，外加两层纱布、一层防水纸进行包扎，取所需的辅液I装入500mL三角瓶中加1倍水进行稀释塞好棉塞包扎好，置于灭菌锅内以温度120～122℃，灭菌20分钟，在接种操作前加入稀释好的辅液I2mL/100mL。5.根据权利要求4所述的辅酶q10生产菌种的培养方法，其特征在于，所述种子培养基包括一级种子培养基和二级种子培养基，在步骤S4中，对母瓶培养基进行残糖测定，当残糖降至0～0.2g/L，菌浓OD≥7.0，湿重30～35g/L时，将母瓶培养基中的菌种按10％的量转入一级种子培养基中摇床培养，当残糖降至0～0.2g/L，菌浓OD≥10.0，湿重35～40g/L时，将一级种子培养基中的菌种按...

【专利技术属性】
技术研发人员：王钱钢，杨晓亮，段建海，谭志云，
申请(专利权)人：丽江映华生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：