镧系金属掺杂碳量子点、镧系金属掺杂碳量子点-核酸适配体偶联物探针的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种镧系金属掺杂碳量子点的制备方法，包括如下步骤：将尿素和镧系金属盐Ln(NO3)3·

【技术实现步骤摘要】
镧系金属掺杂碳量子点、镧系金属掺杂碳量子点
‑
核酸适配体偶联物探针的制备方法及应用


[0001]本专利技术涉及质谱成像金属标记探针
，尤其涉及一种镧系金属掺杂碳量子点、镧系金属掺杂碳量子点
‑
核酸适配体偶联物探针的制备方法及应用。

技术介绍

[0002]质谱流式成像技术(Imaging Mass Cytometry，IMC)融合了免疫染色和质谱技术，能够高度精确地鉴别多种不同的同位素。IMC技术已经被用于组织切片或细胞爬片上超过三十个靶标分子的同时检测。然而，IMC技术也受限于其成像速度慢以及成像分辨率不高，激光烧蚀1mm2的区域大致需要80分钟。因此，只对感兴趣的区域进行IMC分析将大大提高IMC使用效率，若能通过荧光显微成像的快速扫描预先确定感兴趣区域，这将大大节省IMC盲扫时间。然而目前尚未开发出兼具荧光和金属信号的特异性分子探针用于荧光和质谱双模式成像。
[0003]市售的金属标签基于聚合物与金属离子螯合，金属担载量受金属配位效率和聚合度限制，而且聚合物配位的金属标签通过马来酰亚胺基团与IgG抗体上的四个巯基偶联，这对于低表达的标志物分子很难检测。基于纳米颗粒的金属标签大都存在较宽的尺寸范围，导致单颗粒上的金属含量区别较大，因此检测结果与生物标志物的表达高低不具有一致性。同时，纳米颗粒上金属含量过高可能造成仪器等离子体检测器的损坏或管道污染，还常常存在一定的非特异性吸附问题。已经报导过的荧光金属双信号纳米颗粒没有明确的荧光量子产率数据以及细胞爬片和组织切片染色以及用于荧光显微镜和质谱流式双模式成像的适用性验证。
[0004]因此，本领域的技术人员致力于开发一种具备荧光和金属双重信号的特异性探针用于免疫荧光和质谱流式双模式成像。

技术实现思路

[0005]有鉴于现有技术的上述缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是提供可用于细胞爬片或组织切片上的生物标志物特异性标记，并具有荧光和金属双重信号，可用于双光子荧光显微镜成像和质谱流式成像技术的新型探针。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供了一种镧系金属掺杂碳量子点的制备方法，包括如下步骤：
[0007]将尿素和镧系金属盐Ln(NO3)3·
nH2O，溶解于N,N
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二甲基甲酰胺中，室温下磁力搅拌；
[0008]向上述溶液加入柠檬酸，溶解后转移至聚四氟乙烯内衬管内并放入不锈钢反应釜中；
[0009]将拧紧的所述不锈钢反应釜放入马弗炉反应后自然冷却至室温；
[0010]样品溶液转移至离心管内，离心，取上清液，得到沉淀物；
[0011]将所述沉淀物中加入乙醇，超声溶解，离心，取沉淀，重复上述离心直至上清液澄清；
[0012]将所述沉淀用去离子水溶解，用透析袋透析；
[0013]旋蒸浓缩，冻干得到黑色粉末，于干燥箱保存，得到CDs(Ln)。
[0014]本专利技术还提供一种基于上述的镧系金属掺杂碳量子点
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核酸适配体偶联物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0015]取所述CDs(Ln)与1
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(3
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二甲基氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二胺盐酸盐和n
‑
羟基琥珀酰亚胺混合，用无酶水稀释；孵育后，将活化的所述CDs(Ln)与3
’‑
NH2修饰的抗前列腺膜抗原PSMA核酸适配体A10
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3.2在室温下共价连接；最终用磷酸盐缓冲液PBS通过超滤管离心清洗未反应的碳点，得到产物CDs(Ln)
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A10
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3.2偶联物重悬于无酶水。
[0016]本专利技术还提供一种上述的CDs(Ln)
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A10
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3.2在人前列腺癌细胞爬片和人前列腺癌组织切片的荧光显微成像和质谱流式成像中的应用，包括如下步骤：
[0017](1)细胞培养；
[0018](2)细胞爬片；
[0019](3)石蜡切片处理；
[0020](4)细胞爬片及组织切片染色；
[0021](5)质谱+荧光双成像技术对合成CDs(Ln)
‑
A10
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3.2纳米探针的靶向能力验证。
[0022]进一步地，步骤(1)中选择人前列腺癌LNCaP和PC
‑
3细胞系分别为PSMA阳性和阴性表达细胞系，冻存细胞取出后37℃速溶，取15ml离心管，加入10ml含10％体积比胎牛血清的DMEM培养基，将冻存管中液体加入所述离心管中，轻吹混匀，1200转常温离心5min，去掉上清液，加入5ml含血清培养基，轻吹制成细胞悬液，加入到培养瓶中，后将所述培养瓶放置于37℃含50mL/L CO2的培养箱中进行细胞培养。
[0023]进一步地，步骤(2)中IMC仪器装载样本为载玻片，首先，爬片前用丙酮、乙醇和水对所述载玻片以及硅胶模具进行超声清洗，高压消毒灭菌，将所述硅胶模具按压到处理过的所述载玻片上，把细胞培养到对数生长期，消化后滴加到所述硅胶模具内，待1
‑
2天后，细胞接近单层且贴壁完全后，吸取培养基，迅速用PBS漂洗2次，每次3
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5秒，以清除血清；用新鲜配制的预冷的4％多聚甲醛缓冲液室温固定15min，PBS洗涤3遍后晾干保存于
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20℃备用；可长期保存，做实验时，取出片子，PBS湿润后即可进行后续细胞染色实验。
[0024]进一步地，步骤(3)中首先对石蜡包埋的组织切片进行脱蜡和复水，将载玻片放入盛有预热的抗原修复溶液的离心管中95℃放置30min，抗原修复液以能没过组织所在的区域为准；30min后，将含有所述载玻片的离心管放置在实验室工作台上，自然冷却至室温；将所述载玻片转入盛有PBS的染缸，放置10分钟，洗涤，晾干，使用PAP笔在切片周围画圈。
[0025]进一步地，步骤(4)中用CDs(Ln)
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A10
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3.2探针对细胞爬片进行染色，主要考察不同的染色时间和探针浓度对结果的影响，通过共聚焦显微镜观察荧光标记情况，然后用成像质谱流式仪检测金属标记情况，对比二者的成像效果，优化染色条件。
[0026]进一步地，具体实验过程如下：在室温下用含有3％质量比BSA的DPBS对细胞封闭45min；吸去封闭溶液，将金属标记的探针分散液滴到细胞爬片的区域，4℃孵育过夜；用含有0.1％体积比的Triton
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X的DPBS洗8min两次，放在摇床上缓慢摇晃；最后，在室温下用Ir
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Intercalator对细胞爬片区域染色30min，用去离子水冲洗5min，室温晾干，待检测。
[0027]进一步地，步骤(5)中验证过程具体为：安捷伦Cary 60紫外
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可见分光光度计和安捷伦Cary Eclipse荧光光谱仪测量镧系掺杂碳量子点的紫外吸收光谱和光本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种镧系金属掺杂碳量子点的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将尿素和镧系金属盐Ln(NO3)3·
nH2O，溶解于N,N
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二甲基甲酰胺中，室温下磁力搅拌；向上述溶液加入柠檬酸，溶解后转移至聚四氟乙烯内衬管内并放入不锈钢反应釜中；将拧紧的所述不锈钢反应釜放入马弗炉反应后自然冷却至室温；样品溶液转移至离心管内，离心，取上清液，得到沉淀物；将所述沉淀物中加入乙醇，超声溶解，离心，取沉淀，重复上述离心直至上清液澄清；将所述沉淀用去离子水溶解，用透析袋透析；旋蒸浓缩，冻干得到黑色粉末，于干燥箱保存，得到CDs(Ln)。2.一种基于权利要求1的镧系金属掺杂碳量子点
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核酸适配体偶联物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：取所述CDs(Ln)与1
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(3
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二甲基氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二胺盐酸盐和n
‑
羟基琥珀酰亚胺混合，用无酶水稀释；孵育后，将活化的所述CDs(Ln)与3
’‑
NH2修饰的抗前列腺膜抗原PSMA核酸适配体A10
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3.2在室温下共价连接；最终用磷酸盐缓冲液PBS通过超滤管离心清洗未反应的碳点，得到产物CDs(Ln)
‑
A10
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3.2偶联物重悬于无酶水。3.一种基于权利要求2的CDs(Ln)
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A10
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3.2在人前列腺癌细胞爬片和人前列腺癌组织切片的荧光显微成像和质谱流式成像中的应用，其特征在于，包括如下步骤：(1)细胞培养；(2)细胞爬片；(3)石蜡切片处理；(4)细胞爬片及组织切片染色；(5)质谱+荧光双成像技术对合成CDs(Ln)
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A10
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3.2纳米探针的靶向能力验证。4.如权利要求3所述的CDs(Ln)
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A10
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3.2在人前列腺癌细胞爬片和人前列腺癌组织切片的荧光显微成像和质谱流式成像中的应用，其特征在于，步骤(1)中选择人前列腺癌LNCaP和PC
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3细胞系分别为PSMA阳性和阴性表达细胞系，冻存细胞取出后37℃速溶，取15ml离心管，加入10ml含10％体积比胎牛血清的DMEM培养基，将冻存管中液体加入所述离心管中，轻吹混匀，1200转常温离心5min，去掉上清液，加入5ml含血清培养基，轻吹制成细胞悬液，加入到培养瓶中，后将所述培养瓶放置于37℃含50mL/L CO2的培养箱中进行细胞培养。5.如权利要求3所述的CDs(Ln)
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A10
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3.2在人前列腺癌细胞爬片和人前列腺癌组织切片的荧光显微成像和质谱流式成像中的应用，其特征在于，步骤(2)中IMC仪器装载样本为载玻片，首先，爬片前用丙酮、乙醇和水对所述载玻片以及硅胶模具进行超声清洗，高压消毒灭菌，将所述硅胶模具按压到处理过的所述载玻片上，把细胞培养到对数生长期，消化后滴加到所述硅胶模具内，待1
‑
2天后，细胞接近单层且贴壁完全后，吸取培养基，迅速用PBS漂洗2次，每次3
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5...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁显廷，沈广霞，王鑫，余友谊，朱大为，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：