本发明专利技术公开了一种检测食品中羟基甲硝唑残留量的方法及产品。检测所用产品为式I所示羟基甲硝唑半抗原化合物。本发明专利技术依靠免疫学、免疫化学基本原理和残留分析技术手段，设计、合成小分子目标分析物半抗原，并与载体蛋白偶联，制备有效人工抗原，免疫动物制备针对小分子分析物的特异性抗体。利用抗原抗体的特异性免疫学反应，定性或定量检测食品样本中微量小分子目标分析物，具有特异、灵敏、准确、快速、方便、廉价等特点。廉价等特点。廉价等特点。
【技术实现步骤摘要】
一种检测食品中羟基甲硝唑残留量的方法及产品
[0001]本专利技术属于药物残留快速检测领域，涉及一种检测食品中羟基甲硝唑残留量的方法及产品。
技术介绍
[0002]羟基甲硝唑为硝基咪唑类药物甲硝唑的代谢物，由于甲硝唑具有抗菌和抗原虫作用，能杀灭和预防厌氧菌和病原虫，因此在农业生产中常被用于预防和治疗家禽的滴虫病和球虫病、猪密螺旋体性痢疾及动物的各种厌氧菌感染。但甲硝唑具有潜在的致癌、致畸、诱变和遗传毒性作用，其残留对动物性食品构成了威胁。我国《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》（GB 31650—2019）中规定甲硝唑允许作治疗用兽药，但不得在动物性食品中检出。日本规定甲硝唑在食品中不得检出，欧盟和美国均规定了甲硝唑为禁用兽药。甲硝唑在体内吸收快，所以为保障动物源性食品安全，研究动物源食品中甲硝唑代谢物检测的方法具有重要意义。
[0003]目前羟基甲硝唑含量测定方法大多采用液相色谱法或液相色谱串联质谱法，过程繁琐，成本较高。免疫化学分析由于在抗原抗体的定性定量方面独特的优势和操作简便快速、成本低、灵敏度较高、分析样本量大的优点弥补了理化分析的不足，但目前针对食品中羟基甲硝唑免疫检测方法研究较少，本专利技术对该检测方法进行了研究，免疫化学分析法在抗原抗体的定性定量方面具有独特的优势，其操作简便快速、成本低、灵敏度较高、分析样本量大，弥补了理化分析的不足，对于科学使用抗菌药、遏制细菌耐药性、公共健康安全及食品安全具有重大意义。
技术实现思路
[0004]本专利技术的目的是提供一种检测食品中羟基甲硝唑残留量的方法及产品，具有灵敏度高、准确性强、灵敏度高、操作简便的优点。
[0005]本专利技术的一个目的是提供一种羟基甲硝唑半抗原化合物，其结构式如式I所示：Chemical Formula：C
16
H
17
ClN4O6Exact Mass：396.08m/z：396.08(100.0％)，398.08(32.0％)，397.09(17.3％)，399.08(5.5％)，397.08(1.5％)，398.09(1.4％)，398.09(1.2％)
式I本专利技术所提供的制备所述羟基甲硝唑半抗原的方法，具体可包括如下步骤：羟基甲硝唑原料1g，用3ml甲醇钠溶解，加入对苯二甲醛缩二乙醛1.38g，搅拌，TLC 检测反应完全时，加入盐酸淬灭反应，加入硅胶，进行柱层析拌样，旋干后进行柱层析，收 集产物点，旋干得到中间体1，共725mg。
[0006]将725 mg中间体1用盐酸溶液溶解，搅拌，监测反应完全，调PH值到7，旋干溶剂进行柱层析，展开剂比例为二氯甲烷：甲醇=10：1，收集所需溶液，旋干，得到中间体2，共526 mg。
[0007]称取526 mg中间体2，用乙醇溶解，加入羧甲基羟胺470 mg，搅拌，反应完全后，加入硅胶，进行柱层析，收集产物点，旋干溶剂，加入盐酸配置成羟基甲硝唑盐酸盐，得到488 mg羟基甲硝唑半抗原。
[0008]在羟基甲硝唑半抗原的基础上构建所得的羟基甲硝唑抗原也属于本专利技术的保护范围。
[0009]所述羟基甲硝唑抗原，为将所述羟基甲硝唑半抗原（式I）与载体蛋白偶联所得的抗原。在本专利技术的一个实施例中，所述载体蛋白具体为牛血清白蛋白（BSA）或卵清蛋白（OVA）。
[0010]所述羟基甲硝唑抗原的制备方法也属于本专利技术的保护范围。
[0011]在本专利技术中，所述羟基甲硝唑抗原具体是按照包括如下步骤的方法制备获得的：（1）将16.1 mg羟基甲硝唑半抗原（式I）溶解于1.5 mL二甲基甲酰胺（DMF）中，然后加入25.75 mg 1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和15.46 mg N
‑
羟基琥珀酰亚胺（NHS），20
‑
25℃磁力搅拌反应2
‑
3h，得到溶液I；（2）将所述载体蛋白置于0.1M碳酸氢钠缓冲液中，200rpm搅拌10min，充分溶解，得到溶液II；其中，若所述载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA），则所述牛血清白蛋白（BSA）与所述0.1M碳酸氢钠缓冲液的配比为50mg：3.5mL；若所述载体蛋白为卵清蛋白（OVA），则所述卵清蛋白（OVA）与所述0.1M碳酸缓冲液的配比为33.6mg：3.5mL；（3）将所述溶液I和所述溶液II混合，具体为在0
‑
4℃条件下，1000rpm搅拌下，将溶液I逐滴加入到所述溶液II中，500rpm搅拌反应24h，得到溶液III；（4）用磷酸盐缓冲液（0.01M PBS，pH7.2），于4℃对所述溶液III搅拌透析3天，得到所述羟基甲硝唑抗原。
[0012]所述羟基甲硝唑半抗原（式I）或所述羟基甲硝唑抗原在定性或定量检测羟基甲硝唑中的应用也属于本专利技术的保护范围。
[0013]利用所述羟基甲硝唑抗原制备的抗体也属于本专利技术的保护范围。所述抗体可为多克隆抗体、单克隆抗体或抗血清。
[0014]本专利技术还要求保护一种用于检测食品中羟基甲硝唑的方法，包括：用所述羟基甲硝唑抗原或所述抗体对食品进行检测；或者，用所述检测羟基甲硝唑的试剂盒对食品进行检测。
[0015]所述试剂盒包括含不同梯度浓度羟基甲硝唑标准品工作液、包被羟基甲硝唑抗原的酶标板、酶标抗体工作液、抗体工作液、样品稀释液、洗涤液、底物显色液、终止液。
[0016]所述酶标抗体工作液为经辣根过氧化酶标记的羊抗鼠的抗体；规格为1瓶（12mL）。
[0017]所述抗体工作液为将获得的羟基甲硝唑单克隆抗体用抗体稀释液稀释90000倍，获得含有羟基甲硝唑的单克隆抗体工作液；其中，所述抗体稀释液为：1 g环糊精、2 g BSA、35.82 g十二水合磷酸氢二钠、13.6 g磷酸二氢钾、5g氯化钠、1mL Tween
‑
20，0.5 mL Proclin
‑
300，加入100 mL 0.5 mol/L EDTA，900mL去离子水配制而成，规格为1瓶（7 mL）。
[0018]所述样品稀释液为0.01M pH7.4的PBS，规格为1瓶（50 mL）。
[0019]所述洗涤液为0.01M pH7.4的PBST溶液，规格为1瓶（20
×
，25mL）。
[0020]所述底物显色液为底物A液和底物B液各1瓶（7mL）；具体的，所述底物A为2%过氧化脲水溶液；所述底物B为1%四甲基联苯胺水溶液；所述终止液为2 M H2SO4溶液，规格为1瓶（7mL）。
[0021]本专利技术依靠免疫学、免疫化学基本原理和残留分析技术手段，设计、合成小分子目标分析物半抗原，并与载体蛋白偶联，制备有效人工抗原，免疫动物制备针对小分子分析物的特异性抗体。利用抗原抗体的特异性免疫学反应，定量的检测样本中微量小分子目标分析物，具有特异、灵敏、准确、快速、方便、廉价等特点。
附图说明
[0022]图1羟基本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种化合物，其结构如式I所示：2.制备权利要求1所述化合物的方法，包括步骤为：羟基甲硝唑原料1 g，用3 ml甲醇钠溶解，加入对苯二甲醛缩二乙醛1.38 g，搅拌，TLC检测反应完全时，加入盐酸淬灭反应，加入硅胶，进行柱层析拌样，旋干后进行柱层析，收集产物点，旋干得到中间体1，共725 mg；将725 mg中间体1用盐酸溶液溶解，搅拌，监测反应完全，调PH值到7，旋干溶剂进行柱层析，展开剂比例为二氯甲烷：甲醇=10：1，收集所需溶液，旋干，得到中间体2，共526 mg；称取526 mg中间体2，用乙醇溶解，加入羧甲基羟胺470 mg，搅拌，反应完全后，加入硅胶，进行柱层析，收集产物点，旋干溶剂，加入盐酸配置成羟基甲硝唑盐酸盐，得到488 mg羟基甲硝唑半抗原。3.权利要求1所述式I所示羟基甲硝唑半抗原在制备羟基甲硝唑抗原中的应用；含有权利要求1所述式I所示羟基甲硝唑半抗原化合物的羟基甲硝唑抗原。4.根据权利要求3所述应用或羟基甲硝唑抗原，其特征在于：所述式I所示羟基甲硝唑半抗原化合物与载体蛋白偶联；所述载体蛋白具体为BSA或OVA。5.根据权利要求4所述的羟基甲硝唑抗原，其制备方法包括如下步骤：（1）将16.1mg羟基甲硝唑半抗原用1.5ml DMF溶解，200rpm搅拌10min，加入25.75mg EDC，15.46mg NHS溶解，室温搅拌（500rpm）活化2
‑
3h，得到溶液I；（2）将所述载体蛋白置于0.1M碳酸氢钠缓冲液中，200rpm搅拌10min，充分溶解，得到溶液II；所述载体蛋白与所述0.1M碳酸氢钠缓冲液的配比为33.6
‑
50mg：3.5mL；（3）将所述溶液I和所...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘河冰，邢维维，覃丹凤，刘薇，金兴，刘婷，郝建祥，
申请(专利权)人：北京维德维康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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