用于检测大肠杆菌O157:H7的三维光子晶体微球及其检测平台和非标记检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测大肠杆菌O157:H7的三维光子晶体微球及其检测平台和非标记检测方法，所述三维光子晶体微球为表面进行氨基基团修饰和羧基基团修饰的微球，并通过微球上的活泼酯与适配体形成酰胺键将能够特异性识别大肠杆菌O157:H7的氨基化核酸适配体固定于微球表面。本发明专利技术还搭建了检测平台，以智能手机和金相显微镜作为成像和图像采集工具，三维光子晶体微球作为捕获工具。本发明专利技术利用检测平台实现对大肠杆菌O157:H7的定性和定量分析，并且本发明专利技术的检测方法快速简便，检测成本低，特异型好，对大肠杆菌O157:H7的线性检测范围宽，样品量少，满足快速即时检测实际样品中大肠杆菌O157:H7的需求。大肠杆菌O157:H7的需求。大肠杆菌O157:H7的需求。

【技术实现步骤摘要】
用于检测大肠杆菌O157:H7的三维光子晶体微球及其检测平台和非标记检测方法


[0001]本专利技术属于分析检测，具体涉及一种用于检测大肠杆菌O157:H7的三维光子晶体微球及其检测平台和非标记检测方法。

技术介绍

[0002]肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhage Escherichia coli,EHEC)是大肠杆菌的一个亚型，最常见的致病菌之一，包括O157、O111、O26等血清型，大肠杆菌O157:H7(Escherichia coli O157:H7，E.coli O157:H7)是EHEC中最典型的一种血清型。大肠杆菌O157:H7属于条件致病菌，在一定条件下可以引起人和多种动物发生胃肠道感染或尿道等多种局部组织器官感染，其毒性极强且感染剂量极低，50～100个细菌即可引发感染，感染剂量甚至低至5个细菌，致死率2％～10％。被大肠杆菌O157:H7感染后的典型病例一般表现为突然发生的腹部绞痛和非血性腹泻，超过70％的病人数天后发展成出血性腹泻，无粪质，不发热或仅有轻度发热，血白细胞计数增多，30％～60％的病人有呕吐现象；30％的病人有低度发热症状；3％～5％的病人能够发展更加严重的疾病如出血性结肠炎(haemorrhagiccolitis,HC)，并发溶血性尿毒综合症(haemolytic uraemic syndrome,HUS)、血栓性血小板减少性紫癜(thrombocytopenic purpura,TTP)等，导致急性肾衰竭而死亡。大肠杆菌O157:H7因其感染剂量低、传染途径广、致病性和致死率高，目前己成为全球性的公共卫生问题，因此世界各国对大肠杆菌O157:H7的检测开展了大量的研究，其检测方法包括：传统分离鉴定法、免疫学检测法、分子生物学检测法、代谢学检测法等。但是这些常规检测方法均存在一些缺点，比如：操作繁琐且费时费力、仪器昂贵、检测成本高、对操作人员的专业要求很高，难以应用于现场检测和大量样品的检测。因此建立一种快速准确、操作简便、成本低的检测方法，对大肠杆菌O157:H7进行即时有效的监控是十分必要的。

技术实现思路

[0003]专利技术目的：针对现有常规检测技术存在的问题，本专利技术提供了一种用于检测大肠杆菌O157:H7的三维光子晶体微球，该光子晶体微球具有大小可控、粒径均一、比表面积大、独特的光学结构色、探针修饰后能够特异性识别并捕获大肠杆菌O157:H7等优点，有效解决了现有技术中大肠杆菌O157:H7检测操作难，检测方法繁琐，时间长，灵敏度低等问题。
[0004]本专利技术还提供一种用于检测大肠杆菌O157:H7的检测平台及其检测方法。本专利技术的检测方法是基于光子晶体微球结合智能手机在线检测食品中的大肠杆菌O157:H7的方法，该方法可以直接利用三维光子晶体微球结构色结合智能手机和数字图像分析技术对大肠杆菌O157:H7进行无标记的定性和定量检测，无需特殊的示踪标记物，大大降低成本，并且能够有效地解决现有常规检测方法操作繁琐且费时费力、仪器昂贵、检测成本高、对操作人员的专业要求很高，难以应用于现场检测和大量样品的检测的技术难题。
[0005]技术方案：为了实现上述目的，本专利技术所述一种用于检测大肠杆菌O157:H7 的三
维光子晶体微球，所述三维光子晶体微球为表面进行氨基基团修饰和羧基基团修饰的微球，并通过微球上的活泼酯与适配体形成酰胺键将能够特异性识别大肠杆菌O157:H7的氨基化核酸适配体固定于微球表面。
[0006]其中，所述能够特异性识别大肠杆菌O157:H7的氨基化核酸适配体为 5
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NH2‑
C6‑
TGGTCGTGGTGAGGTGCGTGTATGGGTGGTGGATGAGTGTGTGG C
‑3’
。
[0007]本专利技术所述的三维光子晶体微球的制备方法，包括如下步骤：
[0008](1)三维光子晶体微球的制备；
[0009](2)三维光子晶体微球表面的化学修饰：采用双氧水与浓硫酸的混合液处理步骤(1)制备的光子晶体微球，再用3
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氨丙基三乙氧基硅烷对微球表面进行氨基基团的修饰，然后利用琥珀酸对微球表面进行羧基基团的修饰；
[0010](3)氨基化核酸适配体的固定：通过NHS和EDC的作用活化光子晶体微球表面游离的羧基形成活泼酯，然后利用活泼酯与适配体的5
’
端氨基反应形成酰胺键，从而将特异性识别大肠杆菌O157:H7的适配体固定于经过步骤(2)表面修饰的微球表面。
[0011]其中，其中，步骤(1)制备光子晶体微球时，二氧化硅纳米乳液的配方为 A液(氨水11.5mL、双蒸水23mL、无水乙醇15mL)，B液(正硅酸乙酯4.9mL、无水乙醇45.1mL)，制备光子晶体微球所需微流注射泵的参数为：油相8mL/h，乳相5mL/h，其中A液和B液合成乳液后，利用微流注射泵进行组装合成。乳液作为乳相，甲基硅油作为油相。。
[0012]本专利技术所述用于检测大肠杆菌O157:H7的检测平台，所述检测平台包括所述的三维光子晶体微球、智能手机和金相显微镜，所述智能手机和金相显微镜相连接作为成像、图像采集工具和Image J图像处理软件，所述探针修饰的三维光子晶体微球作为捕获工具，通过手机和金相显微镜对捕获大肠杆菌O157:H7的三维光子晶体微球捕进行图像采集，所述Image J图像处理软处理获得图像的灰度值。
[0013]其中，所述金相显微镜采用明场光源模式，其自带的卤素灯提供光源，利用三轴手机支架将智能手机连接，手机支架具有xyz三轴调节的功能，能够让手机稳定的固定于显微镜上，避免手持的不稳定性因素。
[0014]作为优选，所述金相显微镜为采用明场光源模式，物镜放大倍数为40倍，显微镜支架为星特朗三轴手机支架，4800万像素智能手机型号，其相机参数设置专业相机模式，其中测光方式为中央重点测光、相机感光度125、快门60、曝光补偿为自动、手动对焦、自动白平衡、其他参数为自动。
[0015]本专利技术所述用于检测大肠杆菌O157:H7的非标记检测方法，包括如下步骤：
[0016]将所述的三维光子晶体微球暴露在大肠杆菌O157:H7菌液环境中，进行反应，识别并捕获大肠杆菌O157:H7于三维光子晶体微球表面，反应结束后淸洗除去未结合的大肠杆菌O157:H7，使用智能手机和金相显微镜对捕获大肠杆菌 O157:H7的光子晶体微球进行图像采集，利用Image J数字图像处理软件对光子晶体微球的平均灰度值进行计算。
[0017]其中，所述识别并捕获大肠杆菌O157:H7于三维光子晶体微球表面，使得光子晶体微球的透光性、反射率发生改变，进而导致整个体系的颜色发生变化。
[0018]其中，所述Image J图像处理软件对光子晶体微球的结构色进行定量分析，建立颜色和菌液浓度的线性关系，其中采用平均灰度值作为颜色指标进行定量。
[0019]进一步地，将利用偶联适配体后的光子晶体微球选择性识别并捕获样品中的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测大肠杆菌O157:H7的三维光子晶体微球，其特征在于，所述三维光子晶体微球为表面进行氨基基团修饰和羧基基团修饰的微球，并通过微球上的活泼酯与适配体形成酰胺键将能够特异性识别大肠杆菌O157:H7的氨基化核酸适配体固定于微球表面。2.根据权利要求1所述的用于检测大肠杆菌O157:H7的三维光子晶体微球，其特征在于，所述能够特异性识别大肠杆菌O157:H7的氨基化核酸适配体优选为5
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。3.一种权利要求1所述的三维光子晶体微球的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)三维光子晶体微球的制备；(2)三维光子晶体微球表面的化学修饰：采用双氧水与浓硫酸的混合液处理步骤(1)制备的光子晶体微球，再用3
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氨丙基三乙氧基硅烷对微球表面进行氨基基团的修饰，然后利用琥珀酸对微球表面进行羧基基团的修饰；(3)氨基化核酸适配体的固定：通过NHS和EDC的作用活化光子晶体微球表面游离的羧基形成活泼酯，然后利用活泼酯与适配体的5
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端氨基反应形成酰胺键，从而将特异性识别大肠杆菌O157:H7的适配体固定于经过步骤(2)表面修饰的微球表面。4.一种用于检测大肠杆菌O157:H7的检测平台，其特征在于，所述检测平台包括权利要求1所述的三维光子晶体微球、智能手机、金相显微镜和Image J图像处理软件...

【专利技术属性】
技术研发人员：李建林，孙佳隆，焦赛赛，李前进，王思伟，金雨，代士杰，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：