干细胞定向分化心肌细胞的方法技术

本发明专利技术涉及干细胞培养技术领域，尤其涉及干细胞定向分化心肌细胞的方法。本发明专利技术提供的将干细胞定向分化为心肌细胞的方法利用合理的培养基，配合适宜的培养方案能够促进干细胞向心肌细胞分化，8～10天即可获得自发跳动的心肌细胞，培养15天后，Cardiac troponin T阳性的心肌细胞可达84.31％。性的心肌细胞可达84.31％。

【技术实现步骤摘要】
干细胞定向分化心肌细胞的方法


[0001]本专利技术涉及干细胞培养
，尤其涉及干细胞定向分化心肌细胞的方法。

技术介绍

[0002]心血管疾病目前是威胁人类健康的头号杀手。目前的研究发现，成体心脏中并不存在能够再生为心肌细胞的心脏干细胞。因此，心脏损伤后导致数以万计的心肌细胞的死亡具有不可逆性，引起心脏结构重塑和心功能的下降。
[0003]人多能干细胞，包括人胚胎干细胞(human embryonic stemcell,hESC)和人诱导多潜能干细胞(human induced pluripotent stemcell,hiPSC)具有自我更新和多分化的潜能。近年来的研究发现，多能干细胞在体外能够定向分化成心肌细胞。2012年，美国威斯康辛大学Sean P.Paleceka团队发现通过阶段性激活和抑制WNT信号通路，在不含胰岛素的B27体系中，能够高效诱导心肌细胞的分化，相关研究结果发表于PNAS(10.1073/pnas.1200250109)。但该分化体系中的主要成分B27
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ins(A1895601，Gibco)以及B27(17504044，Gibco)中含有大量的牛血清白蛋白(BSA)和其他蛋白成分，且成分不明确，并且该分化体系前期(中胚层)使用B27
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ins，而后才换成B27完全添加剂。2014年，美国斯坦福大学Joseph C Wu团队开发出了仅含有基础培养基(RPMI1640)抗坏血酸以及人白蛋白的化学成分明确的分化系统(CDM3)，利用两种化学小分子CHIR
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99021和Wnt
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C59成功地将11种人诱导多能干细胞系分化成心肌细胞，相关研究成果发表于Nature Methods(10.1038/nmMeth.2999)。但CDM3分化系统中的人白蛋白不仅价格昂贵，且同样无法做到化学成分明确。对于本领域而言，化学成分不明确的培养基，不仅容易造成异源蛋白的排异反应，更重要的是，化学成分不明确的组分在不同批次中表现出较大的差异，往往不能够稳定的实现预期培养效果。目前现存的两种广泛用于人多能干细胞定向分化心肌细胞的体系存在化学成分不明确且分化成本高的问题，无法适用于细胞治疗的临床级标准。而如何在维持良好的分化效果的前提下，避免不能明确化学成分的动物源成分的添加，仍是本领域研究的热点。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供不采用蛋白的干细胞定向分化心肌细胞的方法。
[0005]本专利技术提供的干细胞定向分化心肌细胞的方法，包括：
[0006]第0天起，将密度为70％～90％的干细胞以培养基I培养40～50h，每24h更换新鲜培养基I；
[0007]第2天起，以培养基II继续培养40～50h，每24h更换新鲜培养基II；
[0008]第4天起，以培养基III继续培养40～50h，每24h更换新鲜培养基III；
[0009]第6天起，以培养基II继续培养，每24h更换新鲜培养基II，直至分化为心肌细胞。
[0010]本专利技术研究表明，采用适宜的培养基配合合理的培养方案，能够提高干细胞分化
为心肌细胞的效率，相对于培养基中有效成分配比不佳，或者更换培养液方案不当的对照组，本专利技术提供的培养方法能够更有效的促进干细胞向心肌细胞分化。
[0011]一些实施例中，本专利技术所述的方法包括：
[0012]第0天起，将密度为80％的干细胞以培养基I培养48h，每24h更换新鲜培养基I；
[0013]第2天起，以培养基II继续培养48h，每24h更换新鲜培养基II；
[0014]第4天起，以培养基III继续培养48h，每24h更换新鲜培养基III；
[0015]第6天起，以培养基II继续培养48～120h，每24h更换新鲜培养基II，直至分化为心肌细胞。
[0016]本专利技术中，所述培养基I为含有CHIR
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99021的抗坏血酸、化学成分明确的脂类添加物和双抗的RPMI1640培养基(命名为PFCDM培养基)；
[0017]所述培养基II为含有抗坏血酸、化学成分明确的脂类添加物和双抗的RPMI1640培养基，即PFCDM；
[0018]所述培养基III为含有Wnt
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C59的抗坏血酸、化学成分明确的脂类添加物和双抗的RPMI1640培养基(命名为PFCDM培养基)。
[0019]本专利技术实施例中，
[0020]所述培养基I为含有4～6μmol/L CHIR
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99021的PFCDM培养基；
[0021]所述培养基II为含有200μg/ml～250μg/ml抗坏血酸、1vol％～2vol％化学成分明确的脂类添加物和1wt％双抗的RPMI1640培养基，即PFCDM；
[0022]所述培养基III为含有2μmol/L Wnt
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C59的PFCDM培养基。
[0023]本专利技术中，所述干细胞为胚胎干细胞或诱导多潜能干细胞。
[0024]本专利技术中，所述培养的条件为37℃，饱和湿度，5％CO2。
[0025]判断分化为心肌细胞的标准为：细胞出现自发跳动；表达心肌细胞特异基因TNNT2、MYL2、TNNI3等关键基因。
[0026]一些实施例中，所述干细胞为3～4代的干细胞，其培养方法包括：
[0027]将干细胞依次以DPBS溶液润洗两遍，0.5mM的EDTA溶液润洗一遍，培养基V润洗一遍；然后接种于含有6μmol/L～10μmol/L Y27632培养基V进行培养至密度为80％传代；
[0028]所述接种的密度为0.4
×
105cells/mL～0.6
×
105cells/mL；
[0029]所述培养基V为mTeSR完全培养基(Stemcell公司)。
[0030]本专利技术还提供了一种培养基组合，其包括培养基I、培养基II和培养基III；
[0031]所述培养基I为含有CHIR
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99021的PFCDM培养基；
[0032]所述培养基II为含有抗坏血酸、化学成分明确的脂类添加物和双抗的RPMI1640培养基；
[0033]所述培养基III为含有Wnt
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C59、抗坏血酸、化学成分明确的脂类添加物和双抗的RPMI1640培养基。
[0034]一些实施例中，所述培养基组合中，
[0035]所述培养基I为含有4～6μmol/L CHIR
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99021的PFCDM培养基；
[0036]所述培养基II为含有200μg/ml～250μg/ml抗坏血酸、1vol％～2vol％化学成分明确的脂类添加物和1wt％双抗的RPMI1640培养基，即PFCDM培养基；
[0037]所述培养基III为含有2μmol/L Wnt
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C59的P本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.干细胞定向分化心肌细胞的方法，包括：第0天起，将密度为70％～90％的干细胞以培养基I培养40～50h，每24h更换新鲜培养基I；第2天起，以培养基II继续培养40～50h，每24h更换新鲜培养基II；第4天起，以培养基III继续培养40～50h，每24h更换新鲜培养基III；第6天起，以培养基II继续培养，每24h更换新鲜培养基II，直至分化为心肌细胞；所述培养基I为含有CHIR
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99021的含有抗坏血酸、化学成分明确的脂类添加物和双抗的RPMI1640培养基；所述培养基II为含有Wnt
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C59、抗坏血酸、化学成分明确的脂类添加物和双抗的RPMI1640培养基；所述培养基III为含有抗坏血酸、化学成分明确的脂类添加物和双抗的RPMI1640培养基。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括：第0天起，将密度为80％的干细胞以培养基I培养48h，每24h更换新鲜培养基I；第2天起，以培养基II继续培养48h，每24h更换新鲜培养基II；第4天起，以培养基III继续培养48h，每24h更换新鲜培养基III；第6天起，以培养基II继续培养48～120h，每24h更换新鲜培养基II，直至分化为心肌细胞。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基I为含有4～6μmol/L CHIR
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99021的PFCDM培养基；所述培养基II为含有200μg/ml～250μg/ml抗坏血酸、1vol％～2vol％化学成分明确的脂类添加物和1wt％双抗的RPMI1640培养基；所述培养基III为含有2μmol/L Wnt
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C59、200μg/ml～250μg/ml抗坏血酸、1vol％～2vol％化学成分明确的脂类添加物和1wt％双抗的RPMI1640培养基。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干细胞为胚胎干细胞或诱导多潜能干细胞。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述干细胞为3～4代的干细胞，其培养方法包括：将干细胞依次以DPBS溶液润洗两遍，0.5mM的EDTA溶液润洗一遍，培养基V润洗一遍；然后接种于含有6μmol/L ～10μmol/L Y27632培养基V进行培养至密度为80％传代；所述接种的密度为0.4
×
105cells/mL～0.6
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105cells/mL；所述培养基V为mTeSR完全培养基。...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈振亚，虞游，陈一欢，
申请(专利权)人：苏州大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：