蛋黄IGY多克隆抗体中和，抑制新冠病毒COVID-19的作用制造技术

新冠状病毒COVID

【技术实现步骤摘要】
蛋黄IGY多克隆抗体中和，抑制新冠病毒COVID
‑
19的作用
[0001]
：医学免疫治疗领域。
[0002]
技术介绍
：使用抗原免疫鸡可产生抗体转移和积累于蛋黄中，从蛋黄提取的抗体主要成分是IGY。
[0003]IGY理化性质：
[0004]1，在65℃一个小时活性不变，可以进行巴氏消毒消灭病原体又可以维持活性
[0005]2，在酸性环境PH3
‑
11环境中仍有有比较高的活性。
[0006]3，IGY在体外模拟试验对胃蛋白酶，胰蛋白酶处理后仍有活性。
[0007]上述内容IgY抗体可作为药用或保健品口服
[0008]IgY功能：
[0009]重多文献报导IGY对疾病防治和诊断功能的报导。值得提出的著者杜洪桥综述文章，【卵黄抗体IGY在临床医学中的应用】附件一，抗病毒治疗，胡国柱等以灭活SAS
‑
CoV免疫产蛋母鸡用水稀释法获得IGY，研究发现该抗体提取液稀释1∶512时扔可以中和SARS
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CoY保护50％的VEROE6的细胞不被SARS
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CoV感染。它与SARS患者恢复期血清中和SARS
‑
CoV的效价相同。这说明抗SARS
‑
CoV IGY多克隆抗体可阻断S蛋白与细胞受体结合，抑制SARS
‑
CoV感染VEAOE6细胞。
[0010]实验员苗成等：利用大肠癌细胞免疫产蛋母鸡获得IGY，取10只裸鼠在背部注射(种植)大肠癌细胞，分两组，试验组5只鼠口服IGY抗体，另5只为对照组，结果试验组5只裸鼠3只没有肿瘤生长，2只肿瘤生长R1
‑
2mm.对照组在肿瘤细胞注射部位全部生长肿瘤R3
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5mm.附件二，说明IGY有抑制肿瘤细胞生长作用。

技术实现思路
：
[0011]一、制备N蛋白
[0012]1 2019
‑
nCoV
[0013]从NCBI上查找到2019
‑
nCov基因序列，GenBank号为NC_045512，序列为1260bp，如下所示，送去南京金斯瑞公司合成，经过密码子优化，通过限制性内切酶EcoRI和XhoI构建至pET
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28a表达载体上，记为N蛋白。
[0014]2019
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nCoV原始序列(1260bp)：
[0015][0016][0017]N蛋白氨基酸序列：
[0018][0019]2转化大肠杆菌感受态细胞BL21
[0020]合成后是质粒干粉4ug。加入40uL TE Buffer溶解为100ng/uL。转化至大肠杆菌感受态细胞BL21，涂平板培养过夜。挑取单菌落摇菌，菌液鉴定正确后即可进行蛋白表达。
[0021]3 N蛋白的表达和纯化
[0022]3.1 N蛋白的表达
[0023]取鉴定正确的菌液在小瓶中进行活化，过夜培养，第二天转入大瓶摇菌，生长处于
对数期，OD
600
为0.6～0.8时，加入终浓度为0.01mM的IPTG诱导表达目的蛋白，诱导过夜培养，离心9000rpm，10min，收集菌体，
‑
20度冰箱保存备用。
[0024]3.2 N蛋白的纯化
[0025]称取菌体，按1∶10加入破菌液进行超声破碎，同时实验，确定N蛋白表达在上清。超声破碎后离心收集上清，过镍柱纯化，梯度浓度咪唑缓冲液洗脱目的蛋白，根据SDS
‑
PAGE凝胶电泳胶图，选取洗脱纯度和浓度都较高的洗脱样品，透析出去咪唑，测浓度后保存备用。
[0026][0027]N蛋白氨基酸序列：
[0028][0029]2转化大肠杆菌感受态细胞BL21
[0030]合成后是质粒干粉4ug。加入40uL TE Buffer溶解为100ng/uL。转化至大肠杆菌感受态细胞BL21，涂平板培养过夜。挑取单菌落摇菌，菌液鉴定正确后即可进行蛋白表达。
[0031]3 N蛋白的表达和纯化
[0032]3.1 N蛋白的表达
[0033]取鉴定正确的菌液在小瓶中进行活化，过夜培养，第二天转入大瓶摇菌，生长处于对数期，OD
600
为0.6～0.8时，加入终浓度为0.01mM的IPTG诱导表达目的蛋白，诱导过夜培养，离心9000rpm，10min，收集菌体，
‑
20度冰箱保存备用。
[0034]3.2 N蛋白的纯化
[0035]称取菌体，按1∶10加入破菌液进行超声破碎，同时实验，确定N蛋白表达在上清。超声破碎后离心收集上清，过镍柱纯化，梯度浓度咪唑缓冲液洗脱目的蛋白，根据SDS
‑
PAGE凝胶电泳胶图，选取洗脱纯度和浓度都较高的洗脱样品，透析出去咪唑，测浓度后保存备用。
[0036]二、N蛋白免疫及纯化
[0037]取N蛋白免疫产蛋母鸡。
[0038]每只母鸡N蛋白2mg加完全佐剂加大肠杆菌不耐热蛋白混合，注射鸡的翅膀皮下，10
‑
15天进行第二次加不完全佐剂免疫，50
‑
60天取蛋纯化。纯化方法使用水纯化法，获得IGY抗体每个蛋产率100mg左右
[0039]三、亲和力鉴定
[0040]1，ELISA方法：检测N蛋白免疫IGY活性8ng/ml，1，6ng/ml。附件三。ELSA检测报告。
[0041]2，新冠状病毒COVID
‑
19抗体检测胶体金方法，原理是人体感染新冠状病毒COVID
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19血液中出现IgM，IgG抗体，使用N蛋白标记金，硝酸纤维膜包被IgM，IgG抗抗体。人体被新冠状病毒covid
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19感染的IgM，IgG与N蛋白有亲和力与N蛋白结合也标上金颗粒，层析作用达到硝酸纤维膜上与IgM，IgG抗抗体结合出现红线为阳性。证明N蛋白与新冠状病毒covid
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19有同源性亲和力。。附件四，
[0042]四，综合上述N蛋白免疫禽类获得卵黄IGY多克隆抗体，服用有预防，治疗新冠状病毒COVID
‑
19的作用。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.新冠状病毒COVID
‑
19，N蛋白免疫产蛋母鸡，获得卵黄IGY多克隆抗体有中和，抑制新冠状病毒COVID
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19作用，能够预防治疗新冠状病毒COVID
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19。2.根据权利1，N蛋白作为免疫原，灭活新...

【专利技术属性】
技术研发人员：万积成，万志强，
申请(专利权)人：北京万华生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：