抗H5N1型禽流感病毒药物及其应用制造技术

抗H5N1型禽流感病毒药物及其应用，有效成分为pCAG

【技术实现步骤摘要】
抗H5N1型禽流感病毒药物及其应用
[0001]

[0002]本专利技术属于抗H5N1型高致病性禽流感抗体
，涉及一株抗H5N1型高致病性禽流感病毒全人源抗体组合pCAG
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scFv 1A2
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GFP和IgG1及其应用。
[0003]
技术介绍

[0004]禽流感是由A型流感病毒引起的禽类烈性传染病。近十年来，H5N1 型禽流感肆虐全球，不仅给世界养禽业造成损失，而且随着禽流感病毒基因组的重组或变异，使原来只在禽间传播的少数H5N1 型禽流感病毒获得了能在人体内繁殖的能力，从而具有感染人的能力，主要引起急性肺损伤、急性呼吸窘迫综合征（ARDS）、多脏器功能衰竭等多种并发症，虽然目前尚未有大范围的疫情爆发，但每年都有散发病例的出现；另一方面，由于人体内没有针对H5N1型禽流感病毒抗原的抗体，人感染高致病性禽流感病毒(HPAIV)后则会呈现高发病率和高死亡率的特征，因此，HPAIV 对人类健康和世界公共卫生安全也已构成重大威胁。
[0005]作为化学药物和疫苗的有效补充，由抗体介导的预防和临床治疗措施已显现良好的效果，其应用前景得到专家的认同。作为人体内一种最重要的抗病毒免疫介质，抗体分子可以通过阻断病毒颗粒与其受体的结合、激活巨噬细胞、NK 细胞等杀伤细胞，激活补体和T 细胞效应等多种机制来杀伤、清除病毒颗粒及受感染细胞。抗体不仅可以对流行区的高危易感人群进行紧急被动免疫，对于临床病人还可起到一定的治疗作用。
[0006]病毒是胞内寄居病原体，利用宿主细胞的核酸和蛋白装置来增殖，通过与宿主细胞表面受体的结合，可感染众多的靶细胞。病毒的生命形式存在两种方式：保持感染活性的细胞外形式和显示复制活性的细胞内形式。普通的抗体制剂，受其分子量限制，难以穿透细胞膜进入细胞内，因此，在本研究中，我们将前期研究获得的scFv 1A2基因组通过与高效表达载体连接后由脂质体介导转入细胞内，并进一步表达细胞内抗体，抑制已感染细胞内的病毒的组装，降低胞内病毒的复制速度，通过控制细胞内病毒数量以期待增加宿主细胞自身分泌的I型干扰素（IFN α\β）等细胞因子的分泌，进而促进特异性的CTL (CD8+T)细胞杀伤作用及相关细胞因子的转录水平；另一方面，将scFv 1A2抗体通过基因工程手段构建为含有Fc段的全分子抗体IgG1，使其能中和细胞外的病毒并有效的诱导机体的“抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用”(antibody
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dependent cell
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mediated cytotoxicity，ADCC)生物学效应。通过全人源细胞内抗体和细胞外抗体组合的治疗达到同时抑制细胞内病毒的增殖和细胞外病毒的感染，从而提高机体免疫水平，以期待提高HPAIV感染小鼠的生存率，为进一步探讨有针对性的HPAIV抗体治疗方案奠定基础。
[0007]
技术实现思路

[0008]解决的技术问题：本专利技术针对上述技术问题，提供一种抗H5N1型禽流感病毒药物
及其应用，利用抗H5N1型高致病性禽流感病毒全人源抗体组合pCAG
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scFv 1A2
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GFP和IgG1制备预防和治疗H5N1型禽流感病毒感染药物。
[0009]技术方案：抗H5N1型禽流感病毒药物，有效成分为pCAG
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scFv 1A2
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GFP和IgG1，所述pCAG
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scFv 1A2
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GFP的轻链的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示；所述IgG1的轻链的氨基酸序列如SEQ ID No:5所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID No:6所示。
[0010]pCAG
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scFv 1A2
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GFP轻链的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，重链的核苷酸序列如SEQ ID No:4所示。
[0011]IgG1轻链的核苷酸序列如SEQ ID No:7所示，重链的核苷酸序列如SEQ ID No:8所示。
[0012]抗H5N1型高致病性禽流感全人源抗体pCAG
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scFv 1A2
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GFP和IgG1组合在制备抗H5N1型禽流感病毒药物中的应用，所述pCAG
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scFv 1A2
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GFP的轻链的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示；所述IgG1的轻链的氨基酸序列如SEQ ID No:5所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID No:6所示。
[0013]有益效果：本专利技术以含有抗体scFv1A2 基因的pComb3XSS
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scFv1A2质粒为模板，PCR扩增pComb3XSS
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scFv 1A2 中的scFv 1A2 基因，并同时在片段的两侧添加真核载体的克隆位点序列，产物与高效真核表达载体pCAG
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GFP 经酶切连接后筛选得到阳性重组子pCAG
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scFv 1A2
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GFP，且证明细胞内抗体能够正确表达。本专利技术扩增抗H5N1 型高致病性禽流感病毒小分子scFv1A2抗体的可变区基因VL和VH，分别克隆于L链和H链的盒式真核表达载体pCI
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RV220
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L 和pCI
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RV220
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H 中，构建IgG1 真核表达载体。初步筛选的稳定转染株进一步亚克隆，经过几轮筛选，能够获得每100mL产20mg的蛋白表达量，且全分子IgG1和小分子scFv1A2的结合活性相同，未受Fc片段的影响，亲和力较scFv1A2好。
[0014]细胞内和细胞外抗体及抗体组合的体内体外中和实验表明，全分子IgG1抗体对H5N1型高致病性禽流感病毒的TCID50为10
‑3μg/mL；全分子IgG1在15mg/kg用量时对100 TCID50 的A/Jiangsu/1/2007(H5N1) 病毒感染小鼠的保护率可达到100%；全分子IgG1在15mg/kg，并且辅助30μg pCAG
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scFv
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GFP 时对500 TCID50的A/Jiangsu/1/2007 (H5N1) 病毒感染小鼠的保护率最高可达66.67%。抗H5N1型高致病性禽流感病毒全人源抗体组合pCAG
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scFv 1A2
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GFP和IgG1为抗禽流感病毒人源抗体运用中的一个创新思路。
[0015]附图说明
[0016]图1为重组真核表达载体pCAG
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scFv1A2
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GFP的构建，细胞转染及细胞内抗体表达鉴定;其中A为空载体pCAG
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GFP经PCR扩增后含有750bp左右的GFP条带，重组后的质粒pCAGscFv4F5
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.抗H5N1型禽流感病毒药物，其特征在于，有效成分为pCAG
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scFv 1A2
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GFP和IgG1，所述pCAG
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scFv 1A2
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GFP的轻链的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示；所述IgG1的轻链的氨基酸序列如SEQ ID No:5所示，重链的氨基酸序列如SEQ ID No:6所示。2.根据权利要求1所述抗H5N1型禽流感病毒药物，其特征在于，pCAG
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scFv 1A2
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GFP轻链的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，重链的核苷酸序列如SEQ ...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓，陆辰，刘方舟，李欣妍，狄亚萱，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：