从人多能干细胞获得眼野祖细胞的方法技术

本发明专利技术涉及从hPSC获得眼野祖细胞的方法，所述眼野祖细胞适合进一步分化为例如视网膜色素上皮细胞和/或神经视网膜细胞。该方案提供了具有目的细胞高产量的简单方法，并且有助于转化为GMP合规性。于转化为GMP合规性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】从人多能干细胞获得眼野祖细胞的方法


[0001]本专利技术涉及从人多能干细胞(hPSC)有效获得眼野(eye field)祖细胞的方法，其中所述眼野祖细胞可用于进一步提供用于治疗眼部状况的分化细胞。本专利技术还涉及眼野祖细胞的体外细胞群体及其在治疗眼部状况中的用途。该方案提供了简单、有效的方法，同时也有助于转化为良好生产规范(GMP)合规性。
[0002]序列表的援引并入
[0003]本申请与电子形式的序列表一起提交。该序列表的全部内容通过引用并入本文。
[0004]背景
[0005]世界卫生组织估计全世界有3.14亿人有视力损害，其中2.69亿人视力低下，4500万人失明(Resnikoff S.,2008)。这些眼科病症中的一些是白内障、年龄相关性黄斑变性(AMD)、青光眼、角膜失明和色素性视网膜炎(RP)。
[0006]AMD是一种影响视网膜黄斑区的疾病，其导致中央视力的进行性丧失。AMD的确切发病机理尚未完全阐明，但似乎已经确定，视网膜色素上皮发生萎缩，随后是重要的视网膜结构如神经视网膜细胞的变性，从而导致严重的视力损害。目前，可用的治疗方法有限，而且它们都不能再生丧失的视网膜细胞和修复视力。
[0007]例如用于替代疗法的健康视网膜色素上皮细胞和神经视网膜细胞的细胞植入被认为是例如AMD的可行的治疗方法，以通过延缓或抑制视网膜变性、再生变性的视网膜以及增强视网膜功能来防止失明，甚至恢复有缺陷的视力。
[0008]干细胞是为这样的细胞植入提供有用的细胞疗法的有希望的候选者。多能干细胞的可塑性为研究人眼的发育和再生以应用于包括但不限于AMD和RP的不同类型的视网膜病变提供了新的可能性。然而，获得用于替代疗法的细胞如视网膜色素上皮(RPE)细胞和神经视网膜(NR)细胞仍然是一个挑战。在过去的几年里，已经开发了许多用于hPSC分化的方案，这些方案要么重现了完整的视杯形态发生，要么旨在最大限度地生成特定视网膜细胞亚型。已经描述了用于不同细胞亚型(包括RPE细胞)和特定NR细胞亚型如光感受器(PR)和视网膜神经节细胞(RGC)的方案。向后期眼祖细胞发育是常见的，而分化中的中间细胞类型可被称为视杯祖细胞。大多数可用的方案需要长分化期，部分原因是为了到达视杯祖细胞。更大范围的祖细胞在此被称为早期眼野祖细胞，其包括能够生成不同类型的眼细胞的细胞，这些眼细胞包括但不限于NR细胞，如PR和RGC，RPE细胞、晶状体细胞和角膜细胞，如角膜缘干细胞。在许多情况下，分化方案还依赖于多种成分，如生长因子，这些成分可能是昂贵的和/或难以符合GMP。此外，许多方案受到有限的细胞规格和可重复性的影响。
[0009]本专利技术的一个目的是克服这些挑战中的一些挑战，特别是提供更短、更有效且稳定的方案，所述方案用于在二维设置中获得早期眼野祖细胞，并具有进一步分化为多种后期更成熟的眼祖细胞的能力。本专利技术的另一个目的是提供一种简单的方案，其可以有助于转化为GMP合规性。

技术实现思路

[0010]上述目的通过本专利技术的方面来实现。另外，本专利技术还可以解决从示例性实施方案的公开内容中将会明显看出的其他问题。
[0011]本专利技术的一个方面涉及从hPSC获得眼野祖细胞的改进方法，其包括以下步骤：培养hPSC，将所述hPSC接种在用基质包被的基底上，在细胞培养基中培养所述hPSC以获得分化细胞，使所述分化细胞与Small Mothers Against Decapentaplegic(SMAD)蛋白信号通路抑制剂接触，并使所述分化细胞与BMP5接触，其中让所述分化细胞分化为眼野祖细胞。
[0012]这种改进的方法促进了大量适合进一步分化为后期眼祖细胞的细胞。因此，本专利技术的另一方面涉及可根据本专利技术方法获得的眼野祖细胞的体外细胞群体，其中高百分比的眼野祖细胞共表达PAX6和OTX2，以及由VSX2和MITF组成的组中的至少一种。
[0013]本专利技术人已经表明，激活干细胞中的骨形态发生蛋白(BMP)信号通路可以有效地将分化细胞成熟为具有进一步分化为多种更成熟的眼祖细胞的潜力的早期眼野祖细胞。特别是，本专利技术人已经发现用BMP5激活BMP信号通路在分化细胞方面非常有效。可以进一步分化为更成熟的细胞的这类眼野祖细胞的实例包括但不限于RPE、NR细胞如PR和RGC、晶状体细胞和角膜细胞如角膜缘干细胞(LSC)。
[0014]在本专利技术的一个方面，所述眼野祖细胞是RPE祖细胞。因此，本专利技术还涉及从hPSC获得RPE祖细胞的改进方法，其包括以下步骤：培养hPSC，将hPSC接种到用基质包被的基底上，在细胞培养基中培养所述hPSC以获得分化细胞，使所述分化细胞与SMAD蛋白信号传导抑制剂接触，使所述分化细胞与BMP5接触，以及使所述分化细胞与GSK3抑制剂接触，其中让所述分化细胞分化为RPE祖细胞。
[0015]在本专利技术的一个方面，所述眼野祖细胞是神经视网膜(NR)祖细胞。因此，本专利技术还涉及从hPSC获得NR祖细胞的改进方法，其包括以下步骤：培养hPSC，将hPSC接种到用基质包被的基底上，在细胞培养基中培养所述hPSC以获得分化细胞，使所述分化细胞与SMAD蛋白信号传导抑制剂接触，使所述分化细胞与BMP5接触，其中让所述分化细胞分化为RPE祖细胞。
[0016]本专利技术人已经进一步表明，本专利技术的方案提供了在二维设置中在短时间段内获得早期眼野祖细胞的稳定且有效的方法。该方案提供了目的细胞的高产量，并且该方法有助于转化为GMP合规性。
[0017]附图简述
[0018]图1显示了不同层粘连蛋白在12小时后对人胚胎干细胞(hESC)初始附着的影响。亮视野照片显示了在LN
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521上生长并维持的hESC如何表现出与LN
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332的良好附着，与LN
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111进行对比。单细胞接种后，LN
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332层粘连蛋白显示出对hESC附着的正面影响。LN
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332可用于进一步分化。
[0019]图2A和图2B显示了人BMP5和激活蛋白A对hESC向VSX2和MITF阳性细胞分化的影响。免疫荧光显示条件1和2，无BMP5或激活蛋白A，具有较低水平的MITF或VSX2。相比之下，从第12天起添加BMP5(条件3和4)增加了MITF和VSX2阳性细胞的数目。从第15天起添加激活蛋白A，与BMP5相组合，没有明显的额外效果。相比之下，从第12天起单独使用激活蛋白A，或从第15天起与BMP5相组合(条件5和6)，生成了数目较低的MITF和VSX2阳性细胞。总之，只有BMP5对生成MITF/VSX2阳性细胞显示出强烈的正面影响。IHH(Indian Hedgehog)和DKK2
(Dickkopf信号通路抑制剂2)的组合可能有助于生成MITF/VSX2阳性细胞。
[0020]图3显示，BMP5诱导双PAX6/OTX2阳性细胞的生成。用小分子GW788388、NOGGIN和Endo IWR1初始处理12天，随后用BMP5、IHH本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.从人多能干细胞获得眼野祖细胞的方法，其包括以下步骤：
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培养所述人多能干细胞以获得分化细胞，以及
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使所述分化细胞与BMP5(SEQ ID NO:1)接触，其中让所述分化细胞分化为眼野祖细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述眼野祖细胞是眼睛的不同细胞谱系的多种祖细胞，包括但不限于视杯祖细胞，如RPE祖细胞和NR祖细胞、晶状体祖细胞和角膜祖细胞。3.从人多能干细胞获得眼野祖细胞的方法，其包括以下步骤：
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将所述人多能干细胞接种在用基质包被的基底上，
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在细胞培养基中培养所述人多能干细胞，以获得分化细胞，
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使所述分化细胞与Small Mothers Against Decapentaplegic(SMAD)蛋白信号传导抑制剂接触，以及
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使所述分化细胞与BMP5(SEQ ID NO:1)接触，其中让所述分化细胞分化为眼野祖细胞。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使所述分化细胞与BMP5(SEQ ID NO:1)接触。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中BMP5的浓度为约0.1ng/ml至约2500ng/ml，优选约100ng/ml至约500ng/ml，更优选约150ng/ml至约450ng/ml，甚至更优选约200ng/ml至约400ng/ml。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中使所述分化细胞与选自GW788388、LDN
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193189、LY2157299、LY364947、NOGGIN、RepSOX、SB431542和TEW
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7197的Small Mothers Against Decapentaplegic(SMAD)蛋白信号传导抑制剂接触。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述Small Mothers...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：诺和诺德股份有限公司，
类型：发明
国别省市：