一种鳜鱼脊髓组织细胞系及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种鳜鱼脊髓组织细胞系及其构建方法与应用，该鳜鱼脊髓组织细胞系，于2021年08月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2021226，名称为：鳜鱼脊髓组织细胞系SSC。上述的鳜鱼脊髓组织细胞系可应用于鳜鱼传染性脾肾坏死病毒、鳜鱼蛙虹彩病毒、鳜鱼弹状病毒分离、培养、检测和疫苗制备中。本发明专利技术为分离、鉴定鱼类病毒及病毒疫苗制备提供重要研究平台和实验材料。制备提供重要研究平台和实验材料。制备提供重要研究平台和实验材料。

【技术实现步骤摘要】
一种鳜鱼脊髓组织细胞系及其构建方法与应用


[0001]本专利技术属于水生生物细胞及水产养殖病害防控
，具体地说，涉及一种鳜鱼脊髓组织细胞系及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]鳜鱼(mandarin fish,Siniperca chuatsi)味道鲜美，营养价值高。2019年我国鳜鱼养殖总产量近32万吨，产值突破200亿元。主要在广东、湖北、江西、安徽和江苏等省养殖，其中广东是鳜鱼产量最高的省份。随着鳜鱼养殖规模和密度的迅速扩大，多种病原微生物导致鳜鱼的疾病暴发。影响鳜鱼的病害主要有病毒性疾病、细菌性疾病、寄生虫病，病毒性疾病的危害最为严重，其中传染性脾肾坏死病毒、鳜鱼弹状病毒是影响鳜鱼最严重的病毒性病原。2015年以后，关于鳜鱼蛙虹彩病毒的报道逐渐增多，张文峰(Aquaculture,520(2020):734989.)报道2017年广东省数百个鳜鱼养殖场感染了鳜鱼蛙虹彩病毒，有超过1000万条鳜鱼幼鱼因该病而死亡。鳜鱼蛙虹彩病毒的分离株与大口黑鲈蛙虹彩病毒属于同一分支。因此，目前传染性脾肾坏死病毒、蛙虹彩病毒、弹状病毒是影响鳜鱼的主要病毒性疾病。三种病毒均具有传染性强、致死率高，给鳜鱼养殖业造成了重大的经济损失，严重威胁该产业的健康发展。因此，如何预防和治疗这三种病毒病已成为当今鳜鱼养殖业急需解决的重要问题。细胞系是鱼类免疫学、功能基因组学和环境毒理学研究的强有力的工具，也是研究生物进化、发育和遗传的良好材料。同时，细胞系也是进行鱼类病毒学研究，分离、鉴定鱼类病毒及研制病毒疫苗所必须的材料。
>[0003]鱼类原代细胞系的建立技术目前是一种较为成熟的技术，但是要获得针对病毒敏感的细胞系仍存着很大的偶然性和困难性。殷霞与刘景华在其主编的《动物病毒学》一书中指出，关于哪些类型的细胞对哪些种类的病毒具有敏感性，没有明确的规律性，似乎只能依靠经验，也就是通过实践来发现和验证。所以有效的途径是以数量对质量，即制备各种鱼类各种组织的原代细胞，从中筛选出敏感的细胞系。且同种组织中的不同类型细胞对病毒敏感性也不一样，因此最好进行细胞克隆以便筛选到更敏感的细胞系。目前来源于鳜鱼幼鱼或组织建立的细胞系有二个，一是一株鳜鱼幼鱼细胞系MFF
‑
1，从早期的上皮样细胞与纤维样细胞混合的传到60代时变成了全是上皮样细胞；二是一种鳜脑细胞系的构建方法。但尚未有一种鳜鱼细胞系同时对鳜鱼传染性脾肾坏死病毒、鳜鱼蛙虹彩病毒和鳜鱼弹状病毒敏感。
[0004]因此，建立的对三种病毒同时敏感的鳜脊髓组织细胞系及其构建方法与应用具有创造性和新颖性。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术针对上述的问题，提供了一种鳜鱼脊髓组织细胞系及其构建方法与应用，以鳜鱼脊髓组织为对象，成功建立了鳜鱼脊髓组织细胞系，并对多种病毒感染，为分离、鉴定鱼类病毒及病毒疫苗制备提供重要研究平台和实验材料，同时，本专利技术建立的
方法也可以应用于从其它鱼类建立细胞系。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种鳜鱼脊髓组织细胞系，于2021年08月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2021226，名称为：鳜鱼脊髓组织细胞系SSC。
[0007]本专利技术还公开了一种上述的鳜鱼脊髓组织细胞系的构建方法，包括以下步骤：
[0008]步骤1、脊髓组织的处理：取鳜鱼脊髓组织并进行消毒、切块，处理后浸泡待用；
[0009]步骤2、原代培养：取步骤1处理后的鳜鱼脊髓组织经胰酶消化液消化后进行原代培养；
[0010]步骤3、传代培养：原代培养细胞汇合度达60
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90％时进行传代培养，每5
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7天传代一次。
[0011]可选地，所述的步骤1中取鳜鱼脊髓组织并进行消毒、切块，处理后浸泡待用具体为：取鲜活鳜鱼，用75％酒精对鳜鱼进行消毒，无菌条件下解剖取脊髓组织，切块，浸泡于漂洗液进行漂洗。
[0012]可选地，所述的步骤1中所述的漂洗液为含有400IU/ml青霉素、400μg/ml链霉素的HBSS溶液。
[0013]可选地，所述的步骤2中取步骤1处理后的鳜鱼脊髓组织经胰酶消化液消化后进行原代培养具体为：将步骤1得到的脊髓组织加入胰酶消化液，在室温下消化20
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30min，消化后收集细胞悬液；将细胞悬液加入1
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2ml含血清培养液终止消化，并用100μm滤网过滤，吸取滤液1200r离心5min后，弃上清，沉淀中加入增值培养液重悬，重悬后，置于24
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28℃恒温培养箱开始原代培养，每2
‑
3天按半量换液方式更换增值培养液。
[0014]可选地，所述的胰酶消化液为0.5％Trypsin
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EDTA(10X)；所述的增值培养液为含有20％胎牛血清、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素的L15培养液。
[0015]可选地，所述的步骤3中原代培养细胞汇合度达60
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90％时进行传代培养，每5
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7天传代一次具体为：原代培养细胞长至汇合度达60
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90％时，加入胰蛋白酶消化，用传代培养液悬起细胞，然后接种于培养瓶内在24
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28℃培养箱中培养，每5
‑
7天传代一次。
[0016]可选地，所述的步骤3中传代培养液为含有10
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15％胎牛血清、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素的L
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15培养液。
[0017]本专利技术还公开了一种上述的鳜鱼脊髓组织细胞系在鳜鱼传染性脾肾坏死病毒、鳜鱼蛙虹彩病毒、鳜鱼弹状病毒分离、培养、检测和疫苗制备中的应用。
[0018]与现有技术相比，本专利技术可以获得包括以下技术效果：
[0019]1)本专利技术对鳜鱼脊髓组织细胞进行了原代及传代培养，取得了较好的培养效果，从而建立了鳜鱼脊髓组织细胞系，已连续传至35代。
[0020]2))细胞系可连续传代，因此本专利技术技术方案能提供大量的鳜鱼脊髓组织来源细胞，且细胞增殖或传代培养液配方简单，无需添加外源生长因子，传代细胞能维持良好的生长状态，并可对其进行冷冻保存。
[0021]3)本专利技术所构建的细胞系同时对鳜鱼传染性脾肾坏死病毒、鳜鱼蛙虹彩病毒、鳜鱼弹状病毒均敏感，且对弹状病毒、蛙虹彩病毒细胞病变时间快。因此，该细胞系可很好地应用于鳜鱼病毒的分离、繁殖及病毒疫苗研究。同时，也为其它鱼类病毒的分离培养及疫苗研制等提供了细胞材料。
[0022]当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
[0023]此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本专利技术的一部分，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：
[0024]图1是本专利技术实施例1的鳜鱼脊髓组织传代培养细胞图；
[0025]图2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鳜鱼脊髓组织细胞系，其特征在于，于2021年08月31日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2021226，名称为：鳜鱼脊髓组织细胞系SSC。2.权利要求1所述的鳜鱼脊髓组织细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、脊髓组织的处理：取鳜鱼脊髓组织并进行消毒、切块，处理后浸泡待用；步骤2、原代培养：取步骤1处理后的鳜鱼脊髓组织经胰酶消化液消化后进行原代培养；步骤3、传代培养：原代培养细胞汇合度达60
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90％时进行传代培养，每5
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7天传代一次。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤1中取鳜鱼脊髓组织并进行消毒、切块，处理后浸泡待用具体为：取鲜活鳜鱼，用75％酒精对鳜鱼进行消毒，无菌条件下解剖取脊髓组织，切块，浸泡于漂洗液进行漂洗。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤1中所述的漂洗液为含有400IU/ml青霉素、400μg/ml链霉素的HBSS溶液。5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述的步骤2中取步骤1处理后的鳜鱼脊髓组织经胰酶消化液消化后进行原代培养具体为：将步骤1得到的脊髓组织加入胰酶消化液，在室温下消化20
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30min，消化后收集细胞悬液；将细胞悬液加入1
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2ml含血清的培养液终止消化，并用100...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘晓艺，沈锦玉，蔺凌云，姚嘉赟，尹文林，巩金鹏，刘忆瀚，
申请(专利权)人：浙江省淡水水产研究所，
类型：发明
国别省市：