启动子区域分析方法和用于实施该方法的细胞技术

提供了评估启动子区域活性的方法。所述方法包括培养包含核酸的细胞，所述核酸包含编码可操作地偶联至启动子区域的酶供体(ED)的区域，在其中当所述启动子区域有活性时表达所述ED的条件下培养。所述方法还包括如果表达将所述ED与酶受体(EA)接触以形成具有酶活性的ED

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】启动子区域分析方法和用于实施该方法的细胞
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2019年03月28日提交的美国临时申请系列号62/825,559的优先权，其全部内容在此通过引用并入本文。
[0003]关于政府自助的声明
[0004]无。
专利

[0005]本专利技术一般地涉及评估启动子区域活性的方法，更具体地，启动子区域偶联至检测试剂，以使得启动子区域的表达指导测量启动子区域活性的检测试剂的表达。所公开的方法评估细胞信号转导通路的活性以及待测化合物对细胞信号转导通路的影响。
[0006]对序列表的引用
[0007]本申请包含序列表，该序列表已作为ASCII文本文件提交，并且通过引用整体并入本文。该文本文件创建于2020年03月22日，名称为“PBH_010_1Seq_List.txt”，大小为49,795字节。

技术介绍

[0008]对探索细胞信号转导通路的各个方面以及不同化合物或分子对细胞信号转导通路调节的影响的兴趣一直是了解疾病和寻找治疗方法的关键驱动力。随着越来越多的细胞信号转导通路中的蛋白及其功能被确定，寻找调节这些蛋白活性的分子的兴趣正在急剧增长。通路蛋白的表达或抑制有助于了解待测化合物或测试条件对信号转导通路的影响，并找到新的药用药物。

技术实现思路

[0009]以下简要概述并不旨在包括本专利技术的所有特征和方面，也不意味着本专利技术必须包括本概述中讨论的所有特征和方面。
[0010]本专利技术的很多实施方式提供了一种评估启动子区域活性的方法。在很多其他实施方式中，公开了一种评估启动子区域活性的方法，包括培养包含核酸的细胞，所述核酸包含编码可操作地偶联至启动子区域的第一β
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半乳糖苷酶片段的区域，在其中当所述启动子区域有活性时表达所述第一β
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半乳糖苷酶片段的条件下培养。在其他实施方式中，所述方法还包括如果表达将所述第一β
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半乳糖苷酶片段与第二β
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半乳糖苷酶片段接触以形成活性酶复合物，并且检测酶活性的水平以评估所述启动子区域的活性。在其他实施方式中，所述启动子区域的活性可以是指示性的，因此可以用于评估细胞信号转导通路和/或内源性或外源性(例如，引入的)转录因子的活性。
[0011]在很多实施方式中，本专利技术提供了一种评估启动子区域活性的方法，包括培养包含核酸的细胞，所述核酸包含编码可操作地偶联至启动子区域的酶供体(ED)的区域，在其中当所述启动子区域有活性时表达所述ED的条件下培养。在很多其他实施方式中，所述方
法还包括如果表达将所述ED与酶受体(EA)接触以形成具有酶活性的ED
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EA复合物，并检测所述酶活性水平以评估所述启动子区域的活性。在更进一步的实施方式中，所述ED片段包含SEQ ID NO:30中所示的氨基酸序列或其变体。在其他实施方式中，所述启动子区域的活性可以是指示性的，因此可以用于评估细胞信号转导通路和/或内源性或外源性(例如，引入的)转录因子的活性。
[0012]在其他实施方式中，公开了一种评估启动子区域活性的方法，其中所述方法包括培养包含核酸的细胞，所述核酸包含编码与载体蛋白融合的第一β
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半乳糖苷酶片段的区域，其中所述第一β
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半乳糖苷酶片段可操作地偶联至启动子区域，在其中当所述启动子区域具有活性时表达第一β
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半乳糖苷酶片段
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载体蛋白融合物的条件下培养。在某些实施方式中，所述方法还包括如果表达将所述第一β
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半乳糖苷酶片段与第二β
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半乳糖苷酶片段接触以形成活性酶复合物，并检测所述酶活性的水平以评估所述启动子区域的活性。在很多实施方式中，所述启动子区域的活性可以是指示性的，因此可以用于评估细胞信号转导通路和/或内源性或外源性(例如，引入的)转录因子的活性。在很多其他实施方式中，所述载体蛋白包含经选择以影响所述ED
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载体蛋白融合物的稳定性的结构域，其中与缺乏所述结构域的ED
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载体蛋白融合物相比经选择的所述结构域增加所述ED
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载体蛋白融合物的所述稳定性，或者与缺乏所述结构域的ED
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载体蛋白相比经选择的所述结构域使所述ED
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载体蛋白不稳定。此外，所述载体蛋白结构域靶向所述ED
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载体蛋白融合物进行蛋白酶体降解。所述结构域包含脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)(PEST)降解信号或CL1降解信号。
[0013]在其他实施方式中，公开了一种评估启动子区域活性的方法，其中所述方法包括培养包含核酸的细胞，所述核酸包含编码融合至载体蛋白的酶供体(ED)片段的区域，其中所述ED片段可操作地偶联至启动子区域，在其中当所述启动子区域具有活性时所述ED表达的条件下培养。在某些实施方式中，所述方法还包括如果表达将ED与酶受体(EA)片段接触以形成具有酶活性的ED
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EA复合物，并检测所述酶活性水平以评估所述启动子区域的活性。在很多其他实施方式中，所述载体蛋白包含经选择以影响所述ED
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载体蛋白融合物的稳定性的结构域，其中与缺乏所述结构域的ED
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载体蛋白融合物相比经选择的所述结构域增加所述ED
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载体蛋白融合物的所述稳定性，或者与缺乏所述结构域的ED
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载体蛋白相比经选择的所述结构域使所述ED
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载体蛋白不稳定。
[0014]在很多实施方式中，所述载体蛋白可以具有与β
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半乳糖苷酶酶活性的酶活性不同的可检测的酶活性，其中当所述载体蛋白如所公开的方法中所述表达时，可以使用已知的酶活性检测方法所述检测载体蛋白的酶活性。在很多其他实施方式中，所述载体蛋白在其中所述启动子区域具有活性的条件下表达，以使得可以施用所述检测方法检测所述载体蛋白的酶活性，以评估所述启动子区域的活性。在其他实施方式中，当所述启动子区域具有活性时所述载体蛋白与ED片段的表达是共表达的，其中所述ED片段与所述EA片段形成复合物以形成具有酶活性的活性酶复合物，并且检测这两种载体蛋白与β
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半乳糖苷酶复合物的酶活性水平以评估所述启动子区域的活性。在其他实施方式中，所述启动子区域的活性可以是指示性的，因此可以用于评估细胞信号转导通路和/或内源性或外源性(例如，引入的)转录因子的活性。
[0015]在各种实施方式中，载体蛋白可以是天然蛋白、突变蛋白、合成蛋白，其中通过针
对此类蛋白载体的公知检测方法检测所述载体蛋白酶活性。在其他实施方式中，载体蛋白是突变的，以使得所述突变赋予所述载体蛋白的酶活性失活。在更进一步的实施方式中，突变的载体蛋白可以仅作为与β
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半乳糖苷酶片段融合的载体蛋白起作用，所述β
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半乳糖苷酶片段可操作地连接至目标启动子区域，但当目本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种评估启动子区域活性的方法，包括：在一定条件下培养包含核酸的细胞，所述核酸包含可操作地偶联至启动子区域的编码酶供体(ED)的区域，在所述条件中当所述启动子区域有活性时表达所述ED；如果表达，将所述ED与酶受体(EA)接触以形成具有酶活性的ED
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EA复合物；检测所述酶活性的水平以评估所述启动子区域的活性；和基于所检测的所述酶活性的水平评估转录因子的激活水平。2.根据权利要求所述的方法，其中所述启动子区域包含针对目标转录因子的转录因子应答元件(TFRE)，并且其中所述启动子区域的所述活性指示所述转录因子的活性。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述启动子区域包含至少一个TFRE。4.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括将编码所述转录因子的表达载体引入所述细胞，并且在其中表达所述转录因子的条件下培养所述细胞。5.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括使所述细胞与试剂接触，并且基于所检测的所述酶活性的水平评估响应于所述细胞与所述试剂接触的所述启动子区域的所述活性水平。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述启动子区域的所述活性指示目标细胞信号转导通路的活性。7.根据权利要求5所述的方法，其中使所述细胞与所述试剂接触包括在存在所述试剂的条件下培养所述细胞。8.根据权利要求5所述的方法，其中评估响应于所述细胞与所述试剂接触的所述启动子区域的所述活性水平包括对在不存在所述试剂的条件下检测的所述酶活性水平与在存在所述试剂的条件下检测的所述酶活性水平进行比较。9.根据权利要求5所述的方法，其中所述试剂是小分子。10.根据权利要求5所述的方法，其中所述试剂是检测试剂。11.根据权利要求5所述的方法，其中使所述细胞与超过一种检测试剂接触。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸还编码与所述ED融合的载体蛋白，以使得当所述启动子区域具有活性时表达ED
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载体蛋白融合物。13.根据权利要求14所述的方法，其中所述载体蛋白表现出与所述ED
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EA复合物的酶活性不同的酶活性。14.根据权利要求1所述的方法，其中检测所述酶活性的所述水平包括提供针对所述ED
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EA复合物的底物，其中在所述底物被所述ED
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EA复合物水解后产生可检测的信号。15.根据权利要求1所述的方法，其中所述ED包含SEQ ID NO:30中所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与所述EA复合以形成ED
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EA复合物。16.一种评估启动子区域活性的方法，包括：在一定条件下培养包含核酸的细胞，所述核酸包含编码与酶供体(ED)融合形成ED
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【专利技术属性】
技术研发人员：P沙皮罗，V查里，J林琼斯，J拉默丁，
申请(专利权)人：欧陆迪斯卡沃爱克斯制品有限责任公司，
类型：发明
国别省市：