一种基于WST-8检测NAD制造技术

一种基于WST

【技术实现步骤摘要】
一种基于WST-8检测NAD
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浓度的酶循环方法


[0001]本专利技术涉及分子生物技术和医学检测领域，具体而言，涉及一种基于WST-8检测NAD
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浓度的酶循环方法。

技术介绍

[0002]烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD
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)是细胞氧化还原酶的辅助因子，因在氧化还原反应中的作用而广为人知。最近NAD
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以信号分子的身份重新燃起了科学家的研究兴趣，它作为多种调控蛋白的辅助底物，控制从能量代谢到细胞存活的数百个关键过程。在哺乳动物中，NAD
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主要通过信号蛋白Sirtuins和PARPs调控生命过程。NAD
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水平随着年龄增长而下降，引起细胞核和线粒体功能下降，并导致许多与年龄相关的疾病发生，而补充关键的NAD
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前体，能够提高机体NAD
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水平，增强机体的恢复能力，改善年龄相关的功能缺陷，是一种有效的抗衰老干预措施。因此，提供一种能够准确检测生物样品中NAD
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浓度的方法已经成为本领域亟待解决的技术问题。
[0003]目前，国内外检测生物样品中NAD
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浓度的方法主要有高效液相色谱（HPLC）、高效液相色谱串联质谱（HPLC-MS）、液相二级质谱（HPLC-MS/MS）和酶循环法，前三种方法操作过程复杂、周期长、仪器昂贵且对操作人员要求较高，不适合大规模样本检测。目前，国内外有少量实验室基于MTT（3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐）染料建立酶循环法检测NAD
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浓度，但是MTT生成的甲臜水溶性差，检测误差大，实验结果重复性较差，不适合批量样本检测。

技术实现思路

[0004]为了克服现有技术中NAD
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浓度难以准确、快速、低成本、批量检测的问题，本专利技术在现有基于MTT检测NAD
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的酶循环方法上进行改进，采用WST-8（2-（2-甲氧基-4-硝苯基）-3-（4-硝苯基）-5-（2,4-二磺基苯）-2H-四唑单钠盐）替代MTT染料，利用WST-8生成的甲臜为水溶性的特点，结合WST-8线性范围宽、灵敏度高、重复性好等特点，通过酶循环法实现生物样品中NAD
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快速、准确定量。
[0005]为了达到上述目的，本专利技术采用以下方案：一种基于WST-8检测NAD
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浓度的酶循环方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）β-NAD标准品制备：制备不同浓度的β-NAD标准品；（2）β-NAD质控品制备：制备高、中、低三个浓度的β-NAD质控品；（3）NAD
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提取：将β-NAD标准品、β-NAD质控品、待测生物样品及空白对照中加入NAD
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提取液，处理样本，60℃孵育10min，迅速冰浴平衡10min，加入适量NAD
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中和液，调整PH值至7.4，离心或超滤去除内源性干扰物质，得到NAD
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提取液；（4）NAD
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检测：在酶标板相应孔中先加入β-NAD标准品、β-NAD质控品、待测生物样品及空白对照的NAD
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提取液，后加入反应液，按酶标仪动力学模式检测；（5）数据分析：先扣除空白对照OD值，绘制NAD
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标准曲线，根据β-NAD的标准曲线，计算
并校准生物样品中NAD
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浓度。
[0006]进一步地，上述基于WST-8检测NAD
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的酶循环方法，所述β-NAD标准品的浓度为250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.2ng/ml、15.6ng/ml、7.8ng/ml、3.9ng/ml、1.95ng/ml。
[0007]进一步地，上述基于WST-8检测NAD
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的酶循环方法，所述β-NAD质控品的浓度为187.5ng/ml、125ng/ml、25ng/ml。
[0008]进一步地，上述基于WST-8检测NAD
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的酶循环方法，所述待测生物样品为血清、血浆、尿液、组织液、细胞培养基、血液分离的白细胞和红细胞、组织培养细胞、动物组织块等。
[0009]进一步地，上述基于WST-8检测NAD
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的酶循环方法，所述组织培养细胞为利用生物学细胞培养技术获得的动物细胞。
[0010]进一步地，上述基于WST-8检测NAD
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的酶循环方法，所述空白对照为0.1%DEPC处理水。
[0011]进一步地，上述基于WST-8检测NAD
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的酶循环方法，所述NAD
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提取液为0.3N HCl，NAD
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中和液为0.6 N KOH和0.36 N TEA-HCl的等比例混合液。
[0012]进一步地，上述基于WST-8检测NAD
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的酶循环方法，所述处理样本，血清、血浆、尿液、组织液、细胞培养基，涡旋混匀；细胞，反复冻溶后涡旋混匀；动物组织块，匀浆后涡旋混匀。
[0013]进一步地，上述基于WST-8检测NAD
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的酶循环方法，所述离心或超滤去除内源性干扰物质，血清、血浆、尿液、组织液、细胞培养基，16000g，4℃离心10min；细胞、动物组织块，先16000g，4℃离心10min，后10 kDa超滤管15000g，4℃离心30min。
[0014]进一步地，上述基于WST-8检测NAD
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的酶循环方法，所述反应液为200mM KH2PO4-NaOH（PH8.0）、5%无水乙醇、6%WST-8、1U硫辛酰胺脱氢酶（diaphorase，DI）、125U乙醇脱氢酶、4%BSA溶液、0.1%DEPC处理水。
[0015]进一步地，上述基于WST-8检测NAD
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的酶循环方法，所述酶标仪动力学模式，参数设置为反应温度25℃，检测波长450nm，检测时间30min。
[0016]进一步地，上述基于WST-8检测NAD
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的酶循环方法，所述计算并校准生物样品中NAD
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浓度，细胞、动物组织块NAD
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浓度需要通过样本中蛋白浓度校准为 NAD
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（ng/mg Protein）。
[0017]本专利技术的有益效果是：1. 本专利技术所述的基于WST-8检测NAD
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浓度的酶循环方法，采用乙醇脱氢酶（ADH）的催化特性及酶偶联反应的原理，使反应体系中的NAD
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转化为NADH，通过氧化还原指示剂的介导作用，过度放大NAD
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的信号，提高了检出能力，NAD
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检测限低至1.95ng/ml（2.95nM），克服了生物样品中NAD
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含量低，难以检测的问题；2. 酶循环法本发本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于WST-8检测NAD
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浓度的酶循环方法，其特征在于，包括以下步骤：β-NAD标准品制备：制备不同浓度的β-NAD标准品；β-NAD质控品制备：制备高、中、低三个浓度的β-NAD质控品；NAD
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提取：将β-NAD标准品、β-NAD质控品、待测生物样品及空白对照中加入NAD
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提取液，处理样本，60℃孵育10min，迅速冰浴平衡10min，加入适量NAD
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中和液，调整PH值至7.4，离心或超滤去除内源性干扰物质，得到NAD
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提取液；NAD
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检测：在酶标板相应孔中先加入β-NAD标准品、β-NAD质控品、待测生物样品及空白对照的NAD
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提取液，后加入反应液，按酶标仪动力学模式检测；数据分析：先扣除空白对照OD值，绘制NAD
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标准曲线，根据β-NAD的标准曲线，计算并校准生物样品中NAD
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浓度。2.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述β-NAD标准品的浓度为250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.2ng/ml、15.6ng/ml、7.8ng/ml、3.9ng/ml、1.95ng/ml。3.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述β-NAD质控品的浓度为187.5ng/ml、125ng/ml、25ng/ml。4.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述待测生物样品为血清、血浆、尿液、组织液、细胞培养基、血液分离的白细胞和红细胞、组织培养细胞、动物组织块等。5.根据权利要求 2所述的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：白玉杰，张晓娟，孙海星，王建辉，林思妮，张艳，吴东颖，董红宇，
申请(专利权)人：山东荆卫生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：