一种8a型禽腺病毒毒株、灭活疫苗及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及兽用生物制品技术领域，具体公开了一种8a型禽腺病毒毒株、灭活疫苗及其制备方法和应用。该毒株属于I群E种8a型，命名为DK02株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:V202170。实验表明，本发明专利技术DK02株适应于悬浮LMH细胞(鸡肝癌细胞)且产毒量高，致病力强，免疫原性好。本发明专利技术还提供的DK02株在制备预防包涵体肝炎的疫苗上的应用。本发明专利技术提供一种禽I群腺病毒血清8a型的灭活疫苗，用于预防包涵体肝炎。免疫实验鸡后，能够很好地预防近年来由禽I群8a型腺病毒引起的鸡“包涵体肝炎”，攻毒保护率高，安全性高，抗体产生快，效力稳定。效力稳定。效力稳定。

【技术实现步骤摘要】
一种8a型禽腺病毒毒株、灭活疫苗及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及兽用生物制品
，具体涉及一种I群E种8a型禽腺病毒毒株、灭活疫苗及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]禽腺病毒(Fowladenoviruses)属于腺病毒科的禽腺病毒属成员，为无囊膜的双股DNA病毒。禽腺病毒可分为三个群：禽I群腺病毒具有共同的群抗原，基于交叉中和试验的测定分为5个类型(FAV A～E)，包含12个血清型，代表毒株有血清4型禽I群腺病毒；II群FAV包括火鸡出血性肠炎病毒、雉鸡大理石脾病毒和禽类脾肿大病毒；III群FAV仅包含减蛋综合征病毒(EDSV
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76)。禽I群腺病毒具体分为A、B、C、D、E等5个基因型，按照血清型分为1、2、3、4、5、6、7、8a、8b、9、10、11型；基因型和血清型的对应关系为A(1)、B(5)、C(4、10)、D(2、3、9、11)、E(6、7、8a、8b)。禽腺病毒在感染初期呈隐性感染，死亡率较低，到了感染后期的时候，不同疾病表现出不同的致病性，临床上由禽腺病毒引起的疾病主要有肌胃糜烂、包涵体肝炎和心包积液－肝炎综合征等。自2012年以来，我国疫情呈上升趋势。
[0003]血清8型禽腺病毒又分为8a血清型和8b血清型，主要感染3
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8周龄的各种鸡只，总体死亡率通常在10％以下，但有时可达到30％。该病的特征性病理变化为包涵体肝炎，表现为肝脏褪色呈淡褐色至黄色，质脆易碎，肿胀、呈脂肪变性，表面有不同程度的出血点或出血斑，伴发局灶性坏死，在肝细胞核内可见嗜碱性或嗜酸性的包涵体，边缘较大而清晰，呈圆形或形状不规则。有些病例脾脏肿大、出血。组织病理学特征性变化主要为：肝细胞发生脂肪样变并伴有空泡变性以及部分细胞发生破裂，肝细胞萎缩等。在大多数病例中，肝索分解，肝细胞呈现明显的空泡化，染色切片显示肝细胞明显的空泡化是由脂肪变性引起的。变性和坏死的灶性区域在整个肝组织中随机分布。大多数肝细胞可见不同程度的萎缩、核裂解和核溶解并留下一个或多个大空泡组成的悬浮细胞。部分肝细胞可见细胞核肿胀和染色质边缘化。在许多变性的肝细胞中发现了Cowdry A型核内包涵体。禽I群腺病毒的12个血清型均能使包涵体肝炎发生，但主要是FAdV
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2、FAdV
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8a、FAdV
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8b和FAdV
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11，因血清型和毒株的不同其致病性也存在差异。我国自2012年在10～20周龄的蛋鸡群中开始出现包涵体肝炎，近些年该病在我国的发病率呈上升趋势，给我国的养鸡业造成很大的经济损失。
[0004]禽I群腺病毒既可垂直传播，也可水平传播，但主要以垂直传播为主。病毒可以通过种蛋孵化的形式进行垂直传播，此外也有在鸡胚肾细胞、鸡胚肝细胞。以及鸡场发病的雏鸡体内检测到病毒的相关报道。虽然在1日龄的雏鸡体内就可以分离到病毒，但通常情况下病鸡在感染3周后才开始出现排毒，肉鸡的排毒高峰在4～6周龄，蛋鸡在5～9周龄。病毒主要通过直接接触发病鸡只的粪便进行水平传播，但在小范围内，病毒也可通过空气长时间缓慢传播。
[0005]由禽I群腺病毒引起的鸡包涵体肝炎，给各国的家禽养殖业造成很大的经济损失，目前市场上使用的大多数疫苗鸡胚或组织灭活苗，免疫效果不太理想。禽I群腺病毒的血清型较多，其病毒特性和致病性差异较大，增大了疫苗研制和应用的难度。E8a作为新近流行
的血清型，缺乏具有针对性的疫苗。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种适应于LMH悬浮细胞培养的血清8a型的禽Ⅰ群腺病毒毒株及其应用。分离、鉴定、筛选中国鸡群感染流行的FAdV
‑
8a型致病毒株，经LMH悬浮细胞培养，得到一株优良的、抗原性优异的疫苗毒株，制备相应的疫苗，将对预防禽Ⅰ群8a型腺病毒感染及其他亚型禽腺病毒的感染具有重要意义。
[0007]本专利技术目的实现的技术方案如下：
[0008]首先提供一种禽腺病毒血清8a型DK02株，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，保藏日期为2021年09月17日，保藏号为：CCTCC NO:V202170。所述病毒毒株经鉴定为禽腺病毒Ⅰ群腺病毒中的E种，血清型为8a型，所述病毒可经9～10日龄鸡胚尿囊腔、绒毛尿囊膜、6日龄鸡胚卵黄囊途径培养，也可在鸡肝癌细胞LMH细胞上增殖；禽腺病毒DK02株分离自禽包涵体肝炎
‑
心包积水综合征病死鸡肝脏组织，采用鸡胚分离增殖获得，通过克隆及传代适应能在鸡肝癌细胞上适应增殖，毒株增殖能力强，免疫原性好，适合做疫苗毒株生产灭活疫苗。
[0009]所述毒株制备的生物制品疫苗，含悬浮鸡肝癌细胞培养的禽I群腺病毒DK02株灭活抗原，含量为灭活前≥10
8.5
TCID
50
/0.1ml。
[0010]所述毒株是通过蚀斑克隆纯化得到，具体制备方法包括以下步骤：
[0011](1)选取铺满单层的LMH贴壁细胞，弃掉原培养液，加入含有1％禽腺病毒DK02株病毒液的细胞维持液，置于37℃，5％CO2培养，当细胞病变达80％以上时，冻融2次，收获病毒液，即为F1代病毒，将F1代病毒在LMH贴壁细胞上传代至F5，进行驯化培养；
[0012](2)将F5代禽腺病毒DK02株病毒液用DMEM进行10倍梯度稀释至10
‑5～10
‑9后接种至生长成致密单层的LMH细胞，吸附1h后，弃掉液体，加铺约3mm厚的第一层营养琼脂，所述第一层营养琼脂含有终浓度为1％低熔点琼脂糖和含2％胎牛血清的DMEM，置CO2培养箱，37℃，5％CO2条件下倒置培养48h后，待细胞出现病变时加铺第二层营养琼脂，所述第二层营养琼脂含有终浓度为1％低熔点琼脂糖和含2％胎牛血清的1
×
DMEM，37℃，5％CO2条件下避光倒置培养；
[0013](3)待蚀斑形成后用滴头吸出，连同琼脂糖一起放入1.0ml的不含血清DMEM中，反复冻融3次，使病毒充分释放，接种新的空白LMH细胞，进行病毒增殖，如此重复克隆三次，随机挑选第四代克隆的五个蚀斑，即F9代病毒进行培养，测定病毒含量，分别挑选病毒含量最高的一株毒，通过LMH细胞继续传代，即可获得纯化后的禽I群腺病毒DK02株病毒液。
[0014]该毒株适应于贴壁及悬浮LMH细胞培养，所述方法包括以下步骤：
[0015](1)贴壁LMH细胞制备及病毒接种、收获：选取长势良好的LMH贴壁细胞，弃掉原培养液，加入含有1％禽腺病毒DK02株病毒液的细胞维持液，置于37℃，5％CO2培养，当细胞病变达80％以上时，冻融2次，收获病毒液，即为适应于贴壁LMH细胞培养的DK02株病毒液；
[0016](2)悬浮LMH细胞制备及病毒接种、收获：选取初始密度约为200万的悬浮LMH细胞，将由贴壁LMH细胞扩繁得到的禽腺病毒DK02株基础种毒用DMEM进行适当稀释后接种至悬浮LMH细胞中，于37℃，120rpm振摇培本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种8a型禽腺病毒毒株，其特征在于，所述毒株命名为DK02株，保藏编号为CCTCC NO:V202170，其中，所述病毒毒株为禽Ⅰ群腺病毒中的E种，血清型为8a型，所述病毒可经9～10日龄鸡胚尿囊腔、绒毛尿囊膜、6日龄鸡胚卵黄囊途径培养，也可在鸡肝癌细胞LMH细胞上增殖；禽腺病毒DK02株分离自禽包涵体肝炎
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心包积水综合征病死鸡肝脏组织，采用鸡胚分离增殖获得，通过克隆及传代适应能在鸡肝癌细胞上适应增殖，毒株增殖能力强，免疫原性好，适合做疫苗毒株生产灭活疫苗。2.根据权利要求1所述的毒株，其特征在于，所述毒株制备的生物制品疫苗，含悬浮鸡肝癌细胞培养的禽I群腺病毒DK02株灭活抗原，含量为灭活前≥10
8.5
TCID
50
/0.1ml。3.根据权利要求1所述毒株的制备方法，其特征在于，所述毒株是通过蚀斑克隆纯化得到，具体制备方法包括以下步骤：(1)选取铺满单层的LMH贴壁细胞，弃掉原培养液，加入含有1％禽腺病毒DK02株病毒液的细胞维持液，置于37℃，5％CO2培养，当细胞病变达80％以上时，冻融2次，收获病毒液，即为F1代病毒，将F1代病毒在LMH贴壁细胞上传代至F5，进行驯化培养；(2)将F5代禽腺病毒DK02株病毒液用DMEM进行10倍梯度稀释至10
‑5～10
‑9后接种至生长成致密单层的LMH细胞，吸附1h后，弃掉液体，加铺约3mm厚的第一层营养琼脂，所述第一层营养琼脂含有终浓度为1％低熔点琼脂糖和含2％胎牛血清的DMEM，置CO2培养箱，37℃，5％CO2条件下倒置培养48h后，待细胞出现病变时加铺第二层营养琼脂，所述第二层营养琼脂含有终浓度为1％低熔点琼脂糖和含2％胎牛血清的1
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DMEM，37℃，5％CO2条件下避光倒置培养；(3)待蚀斑形成后用滴头吸出，连同琼脂糖一起放入1....

【专利技术属性】
技术研发人员：夏梦圆，罗意，罗峻，何怡，许俊才，
申请(专利权)人：贵州福牧生物技术研究有限公司，
类型：发明
国别省市：