一株大口黑鲈虹彩病毒及其应用制造技术

本发明专利技术首次从南阳地区分离得到大口黑鲈虹彩病毒，为该病毒毒株本身的研究和流行病学的研究提供了丰富的资源，另外，该病毒毒株具有良好的免疫原性，采用其制备得到的疫苗能够刺激产生高滴度的中和抗体，具有很好的预防作用。用。用。

【技术实现步骤摘要】
一株大口黑鲈虹彩病毒及其应用
[0001]
：本专利技术属于生物
，具体涉及一株新分离的大口黑鲈虹彩病毒及其应用。
[0002]
技术介绍
：大口黑鲈（Micropterus salmoides），俗称加州鲈、黑鲈，原产于北美密西西比河流域，属广温性鱼类，具有生长快、病害少、肉质鲜美、价格高和容易捕捞等众多优点而深受渔民的喜爱。20世纪70年代，大口黑鲈首次引入中国台湾，繁殖了十几代后，于 1983年引入广东省，在深圳、佛山、惠州一带进行人工养殖，佛山顺德地区是大口黑鲈的主要养殖区。因为大口黑鲈大口黑鲈的养殖在国内具有较好的经济效益，在近十几年内已迅速发展成为我国主要的经济养殖鱼种，并被认定为名优品种之一，具有重要的经济价值。大口黑鲈的产量在不断增多，根据中国《2018年中国渔业统计年鉴》分析得出，2017 年全国大口黑鲈养殖产量约为 46 万吨，相比于 2016年增长 31.57%，增长速度为淡水养殖鱼类之首。日渐增长的市场需求使得大口黑鲈的养殖规模逐渐变大，养殖密度也升高，与此同时，大口黑鲈在养殖过程中出现的病害概率也会增多，其中虹彩病毒病是大口黑鲈养殖中常见的病毒性疾病。大口黑鲈蛙虹彩病毒（Largemouth bass ranavirus，LMBV），该病毒最早于1991 年在美国佛罗里达州被发现，大口黑鲈感染该病毒后，通常症状不明显，或体表有出血、眼球突出。2008年至2010年初，顺德地区大口黑鲈养殖鱼塘大面积暴发疾病，造成重大经济损失。对濒死鱼剖检发现鱼鳔肿大，布满红色气腺。鱼鳔、肾脏研磨除菌后，接种鲤鱼上皮瘤细胞（EPC）分离到致病性大口黑鲈虹彩病毒。
[0003]一般认为健康鱼感染大口黑鲈虹彩病毒主要是通过在水体里接触病原或者食入带病鱼饵，人工感染实验和孵化场还未发现垂直传播的病例。大口黑鲈虹彩病毒不仅可以导致大面积鱼暴发疾病死亡引起鱼灾，也可以是不表现任何症状的隐性带毒，这给疾病诊断带来困难。对该病的诊断必须综合流行情况、症状、剖检、病毒分离鉴定等进行判定。大口黑鲈虹彩病毒感染对大口黑鲈有致死性。Zilberg D等进行大口黑鲈虹彩病毒的人工感染试验的结果显示，以106TCID
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/0.1mL剂量通过腹腔注射的方式攻毒，感染后第3天，病鱼呈现螺旋状游动，第4天病鱼体色发黑、无活力、腹部轻度膨大，攻毒鱼在3
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5天内全部死亡，濒死鱼剖检后，所有感染鱼都有急性腹膜炎症状，感染大口黑鲈虹彩病毒的鱼肝脏、胃、肠道和脾脏表层部分出现坏死和炎性病变，鱼鳔与腹腔接触表面有纤维蛋白渗出物，胃肠道的黏膜上皮层有局部坏死病灶。
[0004]由于大口黑鲈虹彩病毒在发病机理、流行病学方面的研究并不深入，再加上野生鱼类带毒情况的普遍性，目前对大口黑鲈虹彩病毒还没有采取有效的防控措施，且鉴于大口黑鲈虹彩病毒感染可以不显现任何症状，并且野生鱼带毒情况较为普遍，从传播途径尽可能切除感染机会也很有必要，因此，疫苗的研发和应用也就成了未来大口黑鲈虹彩病毒病防控的重要方向之一。专利申请CN202011348356.6公开了将柑橘黄酮提取物和黑枸杞花青素提取物添加至工厂化循环水养殖(RAS)系统中，柑橘黄酮提取物和黑枸杞花青素提取物协同作用，抑制虹彩病毒的增殖，解决RAS养殖系统中虹彩病毒引起鱼类患病致死的技术问题；专利申请CN202010052797.5制备得到了一种大口黑鲈虹彩病毒病灭活疫苗；易婉盈
等以表达LMBV外衣壳蛋白（MCP）的重组表达质粒pCDNA3.1（+）
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MCP为材料，构建对LMBV有免疫作用的DNA疫苗，通过胸鳍基部注射的方法免疫大口黑鲈,在攻毒实验中DNA疫苗组的免疫保护率达62.5%，对大口黑鲈虹彩病毒的攻击起到了良好的保护作用。然而，目前在虹彩病毒的防治方面没有特效药物，我国也无商品化的虹彩病毒疫苗，因此，分离合适的疫苗毒株并开展相关的研究，推进疫苗的产业化生产对于大口黑鲈的养殖产业具有积极的意义，也是目前亟需解决的产业问题。
[0005]
技术实现思路
：为了解决大口黑鲈虹彩病毒的预防和治疗难的问题，本专利技术旨在提供一株新分离的大口黑鲈虹彩病毒，并考察其作为疫苗毒株的可能性，研究表明，该毒株具有良好的免疫原性，其所制备的灭活疫苗免疫效果好，相对免疫保护率最高可达100%，可广泛应用于大口黑鲈虹彩病毒感染的防控。
[0006]为解决以上技术问题，本专利技术采用如下技术手段：一株大口黑鲈虹彩病毒N
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201907，其特征在于，所述大口黑鲈虹彩病毒于2020年10月14日在中国典型培养物保藏中心CCTCC进行用于专利程序的培养物的保藏，其保存号为：CCTCC No.V202070，分类命名为大口黑鲈虹彩病毒N
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201907；保藏地址为：湖北省武汉市武汉大学保藏中心。
[0007]所述大口黑鲈虹彩病毒N
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201907采用如下方法分离得到：将采集的大口黑鲈染病样品进行解剖后，无菌条件下取肝脏、脾脏、肾脏等样品，以质量体积比1:8加入无菌生理盐水，冰浴条件下研磨匀浆，将匀浆液分为两份，其中一份在BHI平板、血平板和RS培养基平板上进行划线，28℃培养24h分离细菌，经分离均未分离得到细菌，其表明大口黑鲈相关症状的出现并非细菌感染；另一份转移至50mL离心管中，反复冻融3次后（
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80℃和室温交替冻融），8000g、4℃离心20min，取上清，经灭菌的0.22μm滤器过滤后，将滤液于
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80℃下冻存备用。将鲤鱼上皮瘤细胞（EPC）进行传代培养，至细胞汇合度为85
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90%时，弃去培养基，试验组取200μL滤液与800μL M199培养基混匀，对照组采用200μL无菌PBS与800μL M199培养基混匀，分别接种于健康的EPC细胞，25℃吸附1h，期间每隔20min轻轻晃动培养瓶一遍均匀吸附，吸附完成后添加4mL含有2%胎牛血清的M199培养基，置于25℃ 5%CO2的细胞培养箱中进行培养，每日于显微镜下观察细胞状态至发现实验组细胞单层80%出现细胞病变时收获培养物，反复冻融3次后（
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80℃和室温交替冻融），在 4℃以 4400 g 离心 20 min，去除细胞碎片，即得到病毒原液。将上述病毒原液按照上述步骤感染新的健康EPC细胞，重复至收获第10代病毒液，即得到所述的大口黑鲈虹彩病毒N
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201907。
[0008]本专利技术还请求保护所述大口黑鲈虹彩病毒N
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201907在制备预防和治疗大口黑鲈虹彩病毒感染的药物中的应用。
[0009]优选的，所述药物为灭活疫苗。
[0010]优选的，所述灭活疫苗的制备包括如下步骤：步骤一，EPC细胞的培养；步骤二，大口黑鲈虹彩病毒N
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201907的增殖；步骤本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株大口黑鲈虹彩病毒N
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201907，其特征在于，所述大口黑鲈虹彩病毒于2020年10月14日在中国典型培养物保藏中心CCTCC进行用于专利程序的培养物的保藏，其保存号为：CCTCC No.V202070，分类命名为大口黑鲈虹彩病毒N
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201907；保藏地址为：湖北省武汉市武汉大学保藏中心。2.根据权利要求1所述的大口黑鲈虹彩病毒N
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201907，其特征在于，所述大口黑鲈虹彩病毒N
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201907采用如下方法分离得到：将采集的大口黑鲈染病样品进行解剖后，无菌条件下取肝脏、脾脏、肾脏等样品，以质量体积比1:8加入无菌生理盐水，冰浴条件下研磨匀浆，将匀浆液分为两份，其中一份在BHI平板、血平板和RS培养基平板上进行划线，28℃培养24h分离细菌，经分离均未分离得到细菌，其表明大口黑鲈相关症状的出现并非细菌感染；另一份转移至50mL离心管中，反复冻融3次后（
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80℃和室温交替冻融），8000g、4℃离心20min，取上清，经灭菌的0.22μm滤器过滤后，将滤液于
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80℃下冻存备用；将鲤鱼上皮瘤细胞（EPC）进行传代培养，至细胞汇合度为85
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90%时，弃去培养基，试验组取200μL滤液与800μL M199培养基混匀，对照组采用200μL无菌PBS与800μL M199培养基混匀，分别接种于健康的EPC细胞，25℃吸附1h，期间每隔20min轻轻晃动培养瓶一遍均匀吸附，吸附完成后添加4mL含有2%胎牛血清的M199培养基，置于25℃ 5%CO2的细胞培养箱中进行培养，每日于显微镜下观察细胞状态至发现实验组细胞单层80%出现细胞病变时收获培养物，反复冻融3次后（
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80℃和室温交替冻融），在 4℃以 4400 g 离心 20 min，去除细胞碎片，即得到病毒原液；将上述病毒原液按照上述步骤感染新的健康EPC细胞，重复至收获第10代病毒液，即得到所述的大口黑鲈虹彩病毒N
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201907。3.根据权利要求1所述的大口黑鲈虹彩病毒N
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201907在制备预防和治疗大口黑鲈虹彩病毒感染的药物中的应用。4.根据权利要求3所述的大口黑鲈虹彩病毒N
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201907在制备预防和治疗大口黑鲈虹彩病毒感染的药物中的应用，其特征在于，所述药物为灭活疫苗。5.根据权利要求4所述的大口黑鲈虹彩病毒N
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201907在制备预防...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚伦广，栗丹，邱礽，秦英惠，刘阳坤，管翠翠，
申请(专利权)人：南阳师范学院，
类型：发明
国别省市：