一种体外合成siRNA的纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种体外合成siRNA的纯化方法。本发明专利技术的纯化方法具体指体外转录合成siRNA后进行纯化，得到高纯度的siRNA。具体操作流程：将带有T7启动子的DNA模板体外转录合成siRNA；DNaseI降解DNA模板，S1核酸酶降解单链DNA和RNA；磁珠纯化富集siRNA；核酸吸附柱进一步去除小于20nt的核酸、碱基，以得到纯度很高的siRNA。这种制备方式快捷、便宜，且产物的纯度比市场销售的siRNA体外转录试剂盒要高很多，避免了市售体外转录试剂盒得到的产物中有过多杂质，而使实验结果非常不稳定。极大的提高了体外转录制备siRNA的质量，提高实验效率，减少假阴性的实验结果，具有非常高的推广价值。值。值。

【技术实现步骤摘要】
一种体外合成siRNA的纯化方法


[0001]本专利技术涉及siRNA制备
，尤其涉及一种体外合成siRNA的纯化方法。

技术介绍

[0002]siRNA技术是上个世纪在植物中发现的。由于它可以作为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具，近年来对哺乳动物的研究越来越多。它在生物基因组中特定基因功能的研究、封闭和阻断病原体基因表达等方面，取得了重要进展，显示出良好的应用前景。siRNA技术将在治疗肿瘤、肝炎、遗传性疾病等多种无法治愈的疾病中带来希望，也是目前新药开发的热门。
[0003]全球首款非病毒载体给药的siRNA药物patisiran由Alnylam公司研发，是一种特异性沉默hATTR表达的药物。hATTR是人体转甲状腺素蛋白(transthyretin，TTR)淀粉样蛋白沉积引起的，是一种罕见且难以治愈的遗传病。Patisiran与脂质体形成复合物，通过静脉注射给药，沉默人体内hAATR mRNA的表达，减少转甲状腺素蛋白的产生。迄今，Alnylam公司还研发了siRNA药物Givosiran、Iumasiran、Inclisiran。
[0004]圣诺制药的在研药物STP705就是一种siRNA疗法药物。它由两种siRNA组成，分别以TGF
‑
β1和COX
‑
2的mRNA为靶向，并通过组氨酸
‑
赖氨酸多肽共聚物(HKP)混合成纳米颗粒制剂。每一个siRNA可以抑制其靶标mRNA的表达，两种siRNA的联合使用，具备减少促纤维化和促炎反应的协同作用。该公司临床前研究表明，药物STP705还有肿瘤抑制的效果。
[0005]目前siRNA制备方法有以下几种：1)化学合成法。该方法由核酸合成仪制备得到，适用于短期体外实验研究，可进行化学修饰，如硫代、2
‑
OMe、2
‑
F
’
等。因为化学合成价格成本较高，一条2OD的21bp siRNA售价约600元，如果添加化学修饰，则价格更高，不适用于长期研究；2)质粒载体合成法。该方法将siRNA序列构建到T7或U6启动子的质粒中，质粒转入细胞，在可在细胞内持续产生siRNA，适用于长期研究。该方法价格较贵，构建过程相对复杂，只适用于体外研究；3)病毒载体合成法。该方法用腺病毒载体或逆转录病毒载体整合siRNA，可进行体内实验。该方法构建过程复杂，成功率相对较低，而且具有安全隐患；4)体外转录法。该方法从带T7启动子的DNA单链开始，四种NTP为底物，退火成两条双链DNA作模板，再添加T7酶转录该模板，得到siRNA。市面上现有的体外转录试剂盒中，通常会将获得的产物再做一步纯化，比如磁珠纯化，表示能得到较高纯度的siRNA。该方法价格低廉，且时间短，可以在短时间内制备，适合体内体外实验。通过AKTA设备分析，该方法的不足之处是虽然能得到目标siRNA，但产物纯度仍需进一步提高，由于该方法容易产生较多的杂质，如错配的短核酸、碱基，使得产物并不适合做更高要求医药级水平的研究和应用。到目前为止，获得高纯度的siRNA的快速、高效、稳定的方法依然是核酸生物医药领域研发的重点之一。

技术实现思路

[0006]为了解决现有体外转录法或者市售试剂盒制备的siRNA纯度不高，影响后续实验结果的问题，本专利技术提供了一种全新的体外转录合成后进行纯化的方法，旨在获取高纯度
siRNA的产物。
[0007]本专利技术的第一个目的是提供一种体外合成siRNA的纯化方法，包括如下步骤：
[0008]S1、将含目的基因的DNA单链通过体外转录获得含目的siRNA的体外转录产物；
[0009]S2、采用DNaseI和S1核酸酶对所述的体外转录产物进行消化处理，得到消化产物；
[0010]S3、向所述的消化产物中加入磁珠进行目的siRNA富集处理，得到富集产物；
[0011]S4、采用核酸吸附柱对所述的富集产物进行纯化，得到纯化的siRNA；
[0012]其中，所述的核酸吸附柱中填充至少4层，孔径为8～12nm的核酸吸附膜。
[0013]进一步地，所述的核酸吸附膜为玻璃纤维膜或硅胶膜。
[0014]进一步地，所述的磁珠为硅羟基磁珠、羧基磁珠或氨基磁珠。
[0015]进一步地，所述的磁珠的粒径约0.8～1.2μm，表面电荷约
‑
15～
‑
40mV。
[0016]进一步地，在消化处理时，DNaseI的浓度为0.3U/μl～0.4U/μl。
[0017]进一步地，在消化处理时，S1核酸酶的浓度为0.8U/μl～1.2U/μl。
[0018]进一步地，采用核酸吸附柱对所述的富集产物进行纯化时，具体包括：
[0019]S41、将富集产物上样至核酸吸附柱中，离心去除废液；
[0020]S42、采用RPE Solution对核酸吸附柱上的样品进行清洗，并离心充分去除核酸吸附柱上的液体；
[0021]S43、采用DEPC水溶解核酸吸附柱上的siRNA样品，得到纯化的siRNA。
[0022]进一步地，S41步骤或S42步骤中，离心的条件为10000～14000rpm离心1～3min。
[0023]进一步地，S41步骤中，先向富集产物中加入Buffer A，再加入70％～100％乙醇，混匀后进行上样。
[0024]进一步地，S42步骤中采用RPE Solution对核酸吸附柱上的样品进行清洗时，可重复进行2～4次清洗。
[0025]进一步地，所述的含目的基因的DNA单链中，还包含5
’
端的增强子、T7启动子和3
’
端的dTdT。
[0026]进一步地，体外转录获得含目的siRNA的体外转录产物的步骤包括：
[0027]S11、将四条含目的基因的DNA单链退火成2对双链DNA；
[0028]S12、2对双链DNA各自转录出单链RNA，其中一条为正义链、一条为反义链；
[0029]S13、两条单链RNA退火杂交得到双链RNA，为体外转录产物。
[0030]本专利技术的有益效果是：
[0031]通常市售试剂盒水解siRNA非特异核酸的生物酶是DNaseI和RNase T1，而RNase T1只特异性降解在G残基处的单链RNA，本专利技术是用DNaseI和S1核酸酶，其中S1核酸酶是一种单链特异性核酸内切酶，可水解单链RNA或DNA为5
′
单核苷酸，使用S1核酸酶充分降解粗产物中的单链DNA和RNA，提高双链siRNA的纯度；
[0032]本专利技术在生物酶处理粗产物后连续使用磁珠富集及吸附柱纯化两种方式最大程度的提高目标siRNA的纯度，尤其是本专利技术使用的吸附柱中，填充至少4层以上，孔径是10
±
2nm的玻璃纤维薄膜，使小于20nt的单链、碱基、错配的双链穿过吸附柱，而目标siRNA产物结合在吸附柱中；进一步提高双链本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种体外合成siRNA的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、将含目的基因的DNA单链通过体外转录获得含目的siRNA的体外转录产物；S2、采用DNaseI和S1核酸酶对所述的体外转录产物进行消化处理，得到消化产物；S3、向所述的消化产物中加入磁珠进行目的siRNA富集处理，得到富集产物；S4、采用核酸吸附柱对所述的富集产物进行纯化，得到纯化的siRNA；其中，所述的核酸吸附柱中填充至少4层，孔径为8～12nm的核酸吸附膜。2.根据权利要求1所述的体外合成siRNA的纯化方法，其特征在于，所述的核酸吸附膜为玻璃纤维膜或硅胶膜。3.根据权利要求1所述的体外合成siRNA的纯化方法，其特征在于，所述的磁珠为硅羟基磁珠、羧基磁珠或氨基磁珠。4.根据权利要求3所述的体外合成siRNA的纯化方法，其特征在于，所述的磁珠的粒径约0.8～1.2μm，表面电荷约
‑
15～
‑
40mV。5.根据权利要求1所述的体外合成siRNA的纯化方法，其特征在于，在消化处理时，DNaseI的浓度为0.3U/μl～0.4U/μl。6.根据权利要求1所述的体外合成siRNA的纯化方法，其特征在于，在消化处理时，S1核酸酶的浓度为0....

【专利技术属性】
技术研发人员：李萍，唐雪明，李学文，
申请(专利权)人：硅羿科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：