一种肿瘤靶向抑制试剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种肿瘤靶向抑制试剂及其制备方法和应用，属于基因治疗技术领域。本发明专利技术利用KRT19在乳腺癌细胞、宫颈癌细胞以及人舌鳞状细胞癌中显著过表达，而在正常细胞中的表达水平则较低的性质，KRT19启动子调控PE38KDEL毒素的表达用于乳腺癌、宫颈癌以及人舌鳞状细胞癌的靶向基因治疗是可行的。构建了含有KRT19启动子和毒素的重组质粒，并以乳腺癌细胞MCF

【技术实现步骤摘要】
一种肿瘤靶向抑制试剂及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于基因治疗
，具体涉及一种肿瘤靶向抑制试剂及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]肿瘤已成为威胁人类健康的主要因素，目前针对肿瘤的治疗手段仍然主要以手术、放疗和化疗为主。这些治疗手段对于早期肿瘤患者具有较好的治疗效果，但往往存在较大的毒副作用。同时，由于肿瘤发生的隐蔽性，相当一部分肿瘤患者在发现时已处于中晚期阶段。而这些常规的治疗手段对于此阶段的肿瘤治疗效果并不理想。因此，开发新型肿瘤靶向治疗手段成为当前研究的热点问题。作为一项新型的治疗手段，基因治疗近年来越来越多地受到研究者的重视和青睐，在肿瘤的靶向基因治疗方面展示出了独特的优势。
[0003]KRT19是分子量最小的酸性角蛋白，在正常的上皮或者多种原发性/转移性上皮肿瘤中均有表达。癌细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡等行为会受到KRT19表达水平的调控，不同类型的癌症细胞中的KRT19表达模式有一定的差异。最近有研究表明，在乳腺癌细胞中，KRT19的表达水平显著高于正常组织细胞，特别在浸润性乳腺癌中具有特异性的高表达。KRT19可上调Wnt/β
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catenin信号通路中β
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catenin/RAC1的核转移水平，因此，受β
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catenin介导的Numb表达水平也会有所提高。高度保守的Notch信号通路是决定发育中乳腺细胞命运和细胞分化的关键调节因子之一，作为Notch信号通路的关键抑制蛋白，Numb的表达水平上调会使Notch信号通路受抑制从而失控，这对乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移等行为有影响，甚至有可能使乳腺癌细胞对临床治疗产生耐药性。KRT19在头颈部鳞状细胞癌中也表现出过度的表达。在253名头颈部鳞状细胞癌患者中，HPV阳性的患者KRT19的表达量明显高于HPV阴性患者，同时在转移部位也观察到了更高的KRT19的表达。而与头颈部鳞状细胞癌相比，KRT19则作为宫颈癌的分化基因在宫颈癌的发生和进展中起着重要的作用。
[0004]目前有已经有批准上市的肿瘤靶向药物的报道，但这些药物都是针对某一种肿瘤的治疗，缺乏肿瘤治疗的通用性。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种肿瘤靶向抑制试剂及其制备方法和应用，可同时针对乳腺癌、宫颈癌和头颈部鳞状细胞癌三种肿瘤的基因治疗。
[0006]本专利技术提供了一种肿瘤靶向抑制试剂，包括含外源基因的重组载体；所述外源基因是由KRT19的启动子和具有杀伤肿瘤作用的蛋白的编码基因形成的融合基因。
[0007]优选的，所述KRT19的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008]优选的，所述具有杀伤肿瘤作用的蛋白包括毒素；所述毒素优选包括PE38KDEL。
[0009]优选的，所述毒素PE38KDEL的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
[0010]优选的，所述重组载体的骨架载体包括pGL3
‑
Basic载体。
[0011]优选的，所述pGL3
‑
Basic载体的克隆位点为NcoI和XbaI。
[0012]本专利技术提供了所述肿瘤靶向抑制试剂的制备方法，包括以下步骤：
[0013]1)分别对KRT19的启动子和具有杀伤肿瘤作用的蛋白的编码基因进行PCR扩增，得到带有不同酶切位点的KRT19的启动子和具有杀伤肿瘤作用的蛋白的编码基因片段；
[0014]2)将步骤1)得到的带有酶切位点的KRT19的启动子片段克隆至骨架载体上，得到含KRT19的启动子的重组载体；
[0015]3)将所述含KRT19的启动子的重组载体和带有酶切位点的具有杀伤肿瘤作用的蛋白的编码基因片段分别进行双酶切，连接，得到含KRT19的启动子和具有杀伤肿瘤作用的蛋白的编码基因片段的重组载体。
[0016]本专利技术提供了所述肿瘤靶向抑制试剂在制备基因治疗肿瘤的药物中的应用。
[0017]优选的，所述肿瘤包括以下癌症中的一种或几种：乳腺癌、宫颈癌和人舌鳞状细胞癌。
[0018]本专利技术提供了一种用于靶向抗癌的药物，包括所述肿瘤靶向抑制试剂和药学上可接受的辅料。
[0019]本专利技术提供的肿瘤靶向抑制试剂，包括含外源基因的重组载体；所述外源基因是由KRT19的启动子和具有杀伤肿瘤作用的蛋白的编码基因形成的融合基因。本专利技术基于KRT19基因在特定肿瘤中高表达的特性，将KRT19的启动子和具有杀伤肿瘤作用的蛋白的编码基因形成融合基因片段，利用KRT19的启动子介导毒素片段PE38KDEL的高表达，从而抑制乳腺癌、宫颈癌和头颈部鳞状细胞癌相关细胞中蛋白合成、发生周期阻滞、凋亡，从而实现靶向肿瘤的基因治疗目的。
附图说明
[0020]图1为本专利技术涉及的两种重组质粒构建流程图；
[0021]图2为pKRT19
‑
Luc质粒和pKRT19
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PE38KDEL质粒的酶切鉴定电泳图，M:Trans2K Plus II DNA Marker；a：pKRT19
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Luc质粒双酶切产物；b：pKRT19
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PE38KDEL质粒双酶切产物；
[0022]图3为质粒中的KRT19启动子基因测序序列的BLAST比对结果；
[0023]图4为在不同细胞系TCA8113(人舌鳞状细胞癌)、HeLa(人宫颈癌)、MCF7(人乳腺癌)、Mia Paca
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2(人胰腺导管癌)、A549(人肺癌)和L02(人正常肝脏细胞)中pKRT19
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Luc质粒转染48h后KRT19启动子的表达活性；*P<0.05、**P<0.01；
[0024]图5为各组细胞中蛋白合成的抑制情况；
[0025]图6为流式细胞术检测细胞凋亡情况，其中A.L02细胞转染48h后细胞凋亡散点图；B.MiaPaca
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2细胞转染48h后细胞散点图；C.MCF7细胞转染48h后细胞散点图；D.L02、Mia Paca
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2、MCF7细胞用不同质粒转染48h后的各组细胞凋亡百分比；数据使用Graph Pad Prism 8.0.1软件处理，并用平均值
±
标准差表示，n＝3，和对照组相比(**P<0.01)；
[0026]图7为流式细胞术检测细胞周期阻滞情况；
[0027]图8为用Tranwell检测pKRT19
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PE38KDEL毒素质粒对癌症细胞迁移能力的影响。
具体实施方式
[0028]本专利技术提供了一种肿瘤靶向抑制试剂，包括含外源基因的重组载体；所述外源基
因是由KRT19的启动子和具有杀伤肿瘤作用的蛋白的编码基因形成的融合基因。
[0029]在本专利技术中，所述KRT19的启动子的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:1(5...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤靶向抑制试剂，其特征在于，包括含外源基因的重组载体；所述外源基因是由KRT19的启动子和具有杀伤肿瘤作用的蛋白的编码基因形成的融合基因。2.根据权利要求1所述肿瘤靶向抑制试剂，其特征在于，所述KRT19的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。3.根据权利要求1所述肿瘤靶向抑制试剂，其特征在于，所述具有杀伤肿瘤作用的蛋白包括毒素；优选的，所述毒素包括PE38KDEL。4.根据权利要求3所述肿瘤靶向抑制试剂，其特征在于，所述毒素PE38KDEL的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。5.根据权利要求1所述肿瘤靶向抑制试剂，其特征在于，所述重组载体的骨架载体包括pGL3
‑
Basic载体。6.根据权利要求5所述肿瘤靶向抑制试剂，其特征在于，所述pGL3
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Basic载体的克隆位点为NcoI和XbaI。7.权利要求1～6任意一项所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：施维，沈欣，郭琼，郝翠婷，郭茜，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：