欧美杨107杨离体叶片体胚诱导的方法技术

本发明专利技术属于植物生物技术领域，涉及欧美杨107杨离体叶片体胚诱导的方法，分别采用了胚状体再生途径、不定芽再生途径、解决欧美杨107杨再生率低下、出芽少的问题。其中，胚状体再生途径从叶片诱导到愈伤组织诱导出不定芽用时比不定芽再生途径要长20多天，诱导出来的芽的数量比不定芽再生途径少30多个，还不到不定芽再生途径诱导数量的一半。本发明专利技术中胚状体再生途径主要是为基因工程(基因转化、基因敲除等)、细胞悬浮培养做技术支持。不定芽再生途径主要用于提供脱毒种苗、进行快繁生产。使用本申请方法，愈伤诱导率、出芽率均在95％以上。出芽率均在95％以上。出芽率均在95％以上。

【技术实现步骤摘要】
欧美杨107杨离体叶片体胚诱导的方法


[0001]本专利技术属于植物生物
，具体涉及欧美杨107杨离体叶片体胚诱导的方法。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]欧美杨107杨(Populus
×
euramericana
‘
Neva
’
)是中国林业科学研究院选育并重点推广的速生杨树优良品种，树干通直，材性优良，适于工业用材，在我国北方已推广种植，成为发展农村经济的一项支柱产业。在全国范围退耕还林，退耕还草的形势下，107杨树仍呈现供不应求的趋势。随着107杨的大面积种植，由于长期的扦插繁殖及树种结构的单一，极易受到病虫害的影响。面对病虫害带来的巨大损失，传统育种和农药防治方法不能从根本上解决问题，且在长时间的化学防治下，大大提高了病虫对化学试剂的抗性，并有大量的化学农药进入环境不断积累，危害人类生存环境。
[0004]利用基因技术提高木本植物抗性，是当前抗性育种研究的热点问题。利用植物体胚诱导技术不但能达到保存母株优良基因、快速繁育的目的，还是提高基因遗传转化或诱变育种的重要途径。植物体胚发生是植物离体再生的关键环节，发生途径主要分为直接发生和间接发生两种途径。近年来，越来越多的乔木树种都进行了植物离体再生方面的研究，但体胚发生的诱导条件因物种和培养材料的不同而存在较大差异。
[0005]107杨在生产上广泛采用扦插的方式进行繁殖，对其进行再生体系的研究相对较少或较粗略。孙宇飞(欧美107杨组织培养再生系统的建立.山东师范大学学报(自然科学版)，2004，19(2)：85
‑
87)以嫩茎、嫩叶柄建立了欧美107杨组培再生系统。试验表明：叶片的再生率很低，幼茎和叶柄再生率较高，叶柄出芽率为74％，幼茎出芽率为68％。范晶超(欧美杨
‘
POR
’
组织培养再生系统研究.河南科技大学)本试验以欧美杨
‘
POR
’
的春季新发茎段、叶柄、叶片为外植体，系统地研究了欧美杨不定芽诱导分化、抽茎培养和生根培养的最优条件，建立了完整的组织培养与再生体系。茎段和叶柄诱导分化率分别可达97％和90％，叶片诱导分化率仅为10％。贾小明等对河北杨和新疆杨的离体叶片诱导不定芽进行研究，表明最适分化培养基：1/2MS+6
‑
BA 0.25mg/L+TDZ 0.01mg/L+IAA 0.25mg/L，叶片分化率河北杨达70％，新疆杨达52％。
[0006]上述的方法存在的缺点：茎段和叶柄作为外植体，可诱导愈伤的材料大小远小于叶片，出芽率很高，但是出芽数量少，只有几个，再生率较低。目前，有关107杨的体细胞胚诱导技术研究的较少，可以参考的现有技术比较少。虽然其它树种体细胞胚诱导的成功案例有，但107杨为多年生乔木，基因组庞大，鉴于基因型的限制，其他物种的体细胞胚诱导的繁殖技术对其没有参考价值。

技术实现思路

[0007]为了克服上述问题，本专利技术提供了一种通过间接途径进行欧美杨107杨离体叶片体细胞胚诱导的方法，本专利技术分别采用了胚状体再生途径、不定芽再生途径、解决欧美杨107杨再生率低下、出芽少的问题。二者都可以提供脱毒种苗、进行快繁生产。胚状体再生途径从叶片诱导到愈伤组织诱导出不定芽用时比不定芽再生途径要长20多天，诱导出来的芽的数量比不定芽少，主要是为基因工程(基因转化、基因敲除等)、细胞悬浮培养做技术支持。不定芽再生途径主要用于提供脱毒种苗、进行快繁生产。
[0008]为实现上述技术目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0009]本专利技术的第一个方面，提供了一种用于欧美杨107杨离体叶片体细胞胚诱导的方法，包括：
[0010]将秋季落叶后或春季萌芽前采集一年生枝条进行室内水培，萌发后，取刚刚展开的幼嫩叶片作为外植体；
[0011]将所述幼嫩叶片进行消毒，切除叶片的边缘部分，垂直于叶片主脉轻划几刀
[0012]进行体外诱导培养，体外诱导培养基有如下浓度的原料组成：MS+2.0～2.5mg/L 2，4
‑
D+0.1～0.15mg/L BA+0.1～0.15mg/L NAA+0.05～0.1mg/L TDZ+6.0～8.0g/L琼脂+30～35g/L蔗糖，pH值5.8～6.0；
[0013]对上述培养后的叶片进行不定芽诱导培养，使愈伤组织出现绿色的芽点；
[0014]将带芽点的愈伤组织进行茎段伸长培养，生根培养、炼苗移栽，即得。
[0015]本申请的研究结果与现有研究认为的107杨叶片的再生率很低的观点不一致，利用叶片诱导愈伤，出芽率高达95％以上，远远高于上述研究。
[0016]本申请采用取材方便、诱导率高、出芽数量多的叶片进行107杨体胚诱导，出芽率95％以上，1个叶片出芽数量多达几十个。
[0017]本专利技术使用上述方法，由体胚诱导愈伤组织、不定芽诱导、茎段伸长培养至苗高达到生根高度后，即可转入生根培养基进行生根培养，操作步骤简单，无需调整配方进行壮苗培养。通过本申请提供的培养基和培养方法培养出的植株移栽成活率可达到95％以上，种苗生长健壮。
[0018]本专利技术的第二个方面，提供了一种用于欧美杨107杨离体叶片再生体系建立的方法，包括：
[0019]将秋季落叶后或春季萌芽前采集一年生枝条进行室内水培，萌发后，取刚刚展开的幼嫩叶片作为外植体；
[0020]将所述幼嫩叶片进行消毒，将叶片背面朝上放置，垂直于叶片主脉上划几刀，进行不定芽诱导培养，不定芽诱导培养基有如下浓度的原料组成：MS+0.5～0.6mg/L 6
‑
BA+0.1～0.15mg/L NAA+0.2～0.25mg/L KT+0.2～0.25mg/L TDZ+6.0～8.0g/L琼脂+30～35g/L蔗糖，pH值5.8～6.0，得到带芽点的愈伤组织；
[0021]将所述带芽点的愈伤组织进行茎段伸长培养、生根培养、炼苗移栽，即得。
[0022]本专利技术采用的上述方法由不定芽诱导、茎段伸长培养至苗高达到生根高度后，即可转入生根培养基进行生根培养，操作步骤简单，无需调整配方进行壮苗培养，且培养室内培养条件无需改变，操作简单。通过本申请提供的培养基和培养方法培养出的植株移栽成活率也可达到95％以上，种苗生长健壮。
[0023]本专利技术的有益效果在于：
[0024](1)近年来，越来越多的乔木树种都进行了植物离体再生方面的研究，但体胚发生的诱导条件因物种和培养材料的不同而存在较大差异。行业内始终无法解决欧美杨107杨叶片离体培养的再生率低下、出芽少问题。为此，专利技术人从2018年春天开始做杨树再生，设计了几十个配方，反反复复多少次，才摸索出两个比较成功的配方。现有的参考资料查到的，107杨再生，1个茎段或者叶柄只能诱导出几个本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种欧美杨107杨离体叶片体胚诱导的方法，其特征在于，包括：将秋季落叶后或春季萌芽前采集一年生枝条进行室内水培，萌发后，取刚刚展开的幼嫩叶片作为外植体；将所述幼嫩叶片进行消毒，切除叶片的边缘部分，在叶片主脉划几刀进行体外诱导培养，体外诱导培养基有如下浓度的原料组成：MS+2.0～2.5mg/L 2，4
‑
D+0.1～0.15mg/L BA+0.1～0.15mg/L NAA+0.05～0.1mg/L TDZ+6.0～8.0g/L琼脂+30～35g/L蔗糖，pH值5.8～6.0；对上述培养后的叶片进行不定芽诱导培养，使愈伤组织出现绿色的芽点；将带芽点的愈伤组织进行茎段伸长培养，生根培养、炼苗移栽，即得。2.如权利要求1所述的欧美杨107杨离体叶片体胚诱导的方法，其特征在于，茎段伸长培养采用的伸长培养基由如下浓度的原料组成：MS+0.5～1.0mg/L KT+0.1～0.2mg/L BA+0.1～0.2mg/L NAA+6.0～8.0g/L琼脂+30～35g/L蔗糖，pH值5.8～6.0。3.如权利要求1所述的欧美杨107杨离体叶片体胚诱导的方法，其特征在于，所述生根培养由如下浓度的原料组成：1/2MS+0.2～0.25mg/LIBA+6.0～8.0g/L琼脂+20～25g/L蔗糖，pH值5.8～6.0。4.如权利要求1所述的欧美杨107杨离体叶片体胚诱导的方法，其特征在于，体外诱导培养的条件为昼温度25℃
±
2℃，夜温度18℃
±
2℃，光照强度1500Lx～2000Lx，光照时间14h～16h，黑暗时间10h～8h。5.如权利要求1所述的欧美杨107杨离体叶片体胚诱导的方法，其特征在于，茎段伸长培养的条件为：昼温度25℃
±
2℃，夜温度18℃
±
2℃；光照强度2500Lx～3000Lx，光照时间14h～16h，黑暗时间10h～8h。6.如权利要求1所述的欧美杨107杨离体叶片体胚诱导的方法，其特征在于，包括：将秋季落叶后或春季萌芽前采集一年生枝条进行室内水培，萌发后，取刚刚展开的幼嫩叶片作为外植体；将所述幼嫩叶片进行消毒，将叶片背面朝上放置，在叶片主脉上划几刀，进行不定芽诱导培养，不定芽诱导培养基有如下浓度的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李双云，乔艳辉，朱士利，李善文，韩友吉，张晓艳，董玉峰，姚俊修，
申请(专利权)人：山东省林业科学研究院，
类型：发明
国别省市：