一种诱导番茄花药愈伤组织快速增殖的方法技术

本发明专利技术属于番茄育种技术领域，具体公开一种诱导番茄花药愈伤组织快速增殖的方法，包括以下步骤，外植体的选择；外植体消毒；预处理：将灭菌后的花蕾切开取出花药，接种于愈伤组织分化培养基MS+1mg/L 6

【技术实现步骤摘要】
一种诱导番茄花药愈伤组织快速增殖的方法


[0001]本专利技术属于番茄育种
，涉及一种诱导番茄花药愈伤组织快速增殖的方法。

技术介绍

[0002]番茄属于茄科番茄属一年生或多年生草本植物，原产于南美西部高原秘鲁、厄瓜多尔一带。番茄在我国仅有一百多年的栽种历史，但由于番茄风味独特、营养价值丰富，其内含的番茄红素及胡萝卜素具有抗氧化、抗衰老和预防癌症等功效而深受广大消费者的喜爱；并且番茄在栽培后能够取得较好的经济效益，故在国内外的栽培面积都在不断扩大。
[0003]近年来，我国的番茄种植面积及产量常年保持在110万hm2和5500万t以上，占全国蔬菜总产量的7%左右。但随着栽培面积的逐步扩大，番茄病害蔓延迅速，番茄黄化曲叶病毒病、褪绿病毒病、斑萎病毒病等病毒病在我国番茄各大主产区频发，对我国番茄的产量和品质造成了极大的危害，严重威胁到了我国番茄的安全生产。对于番茄多抗、优质的高端品种的需求越发迫切，但由于我国番茄栽培历史较短，番茄资源丰度及育种手段均与国外育种公司存在较大差距，故加快培育具有自主知识产权的优质多抗的番茄品种任重道远。
[0004]番茄属于自花授粉作物。目前国内的番茄育种多采用常规育种手段，经过多代自交提纯分离后获得纯系，但传统育种方法存在耗时、费工及多代自交后代植株易出现自交衰退等诸多问题，严重影响番茄育种进度。而双单倍体育种技术近年来逐渐成为育种家研究的热点，其花药培养及游离小孢子培养技术可以诱导花药雄核发育而形成单倍体植株，从而创制出具有目标性状的育种材料，可极大的缩短育种时间，提高育种效率，是一种番茄育种有效手段。但番茄属难用于诱导单倍体植株再生的顽拗性作物，目前番茄花药培养及游离小孢子培养技术均不成熟，大部分研究均集中在小孢子发育时期选择、非生物胁迫诱导、培养基选择及激素组合研究等方面，而研究结果大多停滞在花药愈伤组织或多细胞团及多核体阶段，且花药愈伤组织诱导率均较低。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种诱导番茄花药愈伤组织快速增殖的方法，为番茄双单倍体育种奠定基础。
[0006]为实现以上目的，本专利技术提供以下技术方案：一种诱导番茄花药愈伤组织快速增殖的方法，包括以下步骤：（1）外植体的选择：选择生长健壮的番茄植株上花粉发育时期处于单核靠边期的番茄花药作为外植体；（2）外植体消毒；（3）预处理：将灭菌后的花蕾切开取出花药，接种于愈伤组织分化培养基MS+1mg/L 6
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BA+0.5mg/LNAA+0.1mg/L 2,4
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D+40g/L蔗糖中，放入4℃冰箱预处理24h；（4）愈伤组织分化培养：预处理完成后，将其放入25℃培养箱暗培养一周，后在25
℃培养箱中光照培养14h/d，光照强度2500lx，两周更换一次培养基，直至愈伤形成；（5）诱导愈伤组织快速增殖：待愈伤组织形成后，切下愈伤组织转接到愈伤增殖培养基MS+0.1mg/LZT+1mg/L6
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BA+0.5mg/LNAA+300mg/L水解酪蛋白30mg/L α
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维生素E+40g/L蔗糖中进行愈伤增殖培养。
[0007]所述步骤（1）中，外植体于清晨7
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8点时采摘，采摘番茄花蕾后立即放入冰盒。
[0008]本专利技术所述步骤（1）中所选花粉发育时期处于单核靠边期的番茄花药形态大致为花蕾即将开放，花瓣完全闭合，萼片矮于花瓣，花瓣及花药均为黄绿色状态，且必须选择生长健壮的番茄植株上的花蕾。
[0009]所述步骤（2）中，外植体消毒的步骤为：将已采摘的番茄花蕾先用洗洁精快速清洗一遍，再用流水冲洗2
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3分钟，滤纸吸干水分，在75%酒精中浸泡20s，灭菌水清洗3次，7%次氯酸钠溶液中浸泡9min，灭菌水清洗3次，用灭菌滤纸吸干水分备用。
[0010]本专利技术所述步骤（2）中采摘花蕾先用洗洁精清洗一遍后可以大大降低污染率，在用75%酒精和1%次氯酸钠浸泡过程中要不断摇晃瓶体，使消毒液与花蕾充分接触，且用无菌水清洗后必须用无菌滤纸吸干花蕾上的水分，否则花蕾在后期操作过程中褐化严重。
[0011]所述本专利技术适用的番茄为大中型粉果番茄。
[0012]本专利技术的有益效果是：1、采用本专利技术进行番茄花药愈伤诱导时，适宜花药培养的外植体选择容易，可从花药外观形态判断其花粉发育时期，不用每次试验都采用镜检及测量花蕾长度来确定花药发育时期，极大简化了试验操作流程，节约了大量时间成本。
[0013]2、本专利技术采用先接种后进行低温预处理的方式刺激愈伤组织形成，可使番茄花药愈伤组织诱导率比ck高15.7%。
[0014]3、3、本专利技术以番茄花药为外植体，利用植物组织培养技术成功诱导出番茄花药愈伤组织，诱导率高达48%，并对诱导出的愈伤组织进行100%快速增殖，增殖系数达4.25；大量番茄花药愈伤的获得为再生单倍体植株奠定坚实的基础，对番茄单倍体育种技术的推进具有重要意义。
附图说明
[0015]图1 为番茄花药培养示意图（A为番茄花药刚接种到培养基上的示意图；B为番茄花药分化出愈伤组织的示意图；C为番茄愈伤组织刚接种到愈伤组织增殖培养基中的示意图;D为番茄愈伤组织增殖后的示意图）。
具体实施方式
[0016]下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术所使用的材料均在市场可以进行购买，所使用的番茄品种亮粉和粉莹购买于云南思农蔬菜种业发展有限责任公司；正康198购买于元谋正康农业科技有限责任公司。
[0017]实施例1
以亮粉品种花药为外植体；一种诱导番茄花药愈伤组织快速增殖的方法，具体实施步骤：步骤1，适宜外植体的选择：选择生长健壮的番茄植株上花粉发育时期处于单核靠边期的番茄花药作为外植体，在清晨7
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8点时，采摘番茄花蕾后立即放入冰盒（放有冰块的保温泡沫盒）；步骤2，外植体消毒：将已采摘的番茄花蕾先用洗洁精快速清洗一遍，再用流水冲洗2
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3分钟，滤纸吸干水分，在75%酒精中浸泡20s，灭菌水清洗3次，7%次氯酸钠溶液中浸泡9min，灭菌水清洗3次，用灭菌滤纸吸干水分；步骤3，预处理：将灭菌后的花蕾切开取出花药，接种于愈伤组织分化培养基MS+1mg/L 6
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BA+0.5mg/L NAA+0.1mg/L 2,4
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D+40g/L蔗糖中，放入4℃冰箱预处理24h；步骤4，愈伤组织分化培养：预处理完成后，将其放入25℃培养箱暗培养一周，后在25℃培养箱中光照培养14h/d，光照强度2500lx，两周更换一次培养基，直至愈伤形成；步骤5，诱导愈伤组织快速增殖：待愈伤组织形成后，切下愈伤组织转接到愈伤增殖培养基MS+0.1mg/L ZT+1mg/L 6
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种诱导番茄花药愈伤组织快速增殖的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）外植体的选择：选择生长健壮的番茄植株上花粉发育时期处于单核靠边期的番茄花药作为外植体；（2）外植体消毒；（3）预处理：将灭菌后的花蕾切开取出花药，接种于愈伤组织分化培养基MS+1mg/L 6
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BA+0.5mg/LNAA+0.1mg/L 2,4
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D+40g/L蔗糖中，放入4℃冰箱预处理24h；（4）愈伤组织分化培养：预处理完成后，将其放入25℃培养箱暗培养一周，后在25℃培养箱中光照培养14h/d，光照强度2500lx，两周更换一次培养基，直至愈伤形成；（5）诱导愈伤组织快速增殖：待愈伤组织形成后，切下愈伤组织转接到愈伤增殖培养基MS+0.1mg/LZT+1mg/L6
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BA+0.5mg/LNAA+300m...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪玲敏，但忠，木万福，麻继仙，杨龙，李易蓉，苏银玲，唐正富，吕维梧，李丽琼，陈光平，杨子祥，
申请(专利权)人：云南省农业科学院热区生态农业研究所，
类型：发明
国别省市：