可避免细胞内GSH干扰的Cys荧光探针及制备和应用制造技术

本发明专利技术涉及荧光探针领域，具体涉及一种可避免细胞内GSH干扰的Cys荧光探针及制备和应用。近年来一系列高选择性Cys荧光探针被相继开发，这些探针尽管在一定程度上排除了GSH引发的荧光信号的干扰，但GSH消耗探针所带来的敏感性降低的限制仍然没有有效地克服。为解决上述问题，本发明专利技术开发了一种不受GSH干扰的特异性Cys荧光探针及其制备和应用，该荧光探针不仅能直接与Cys反应产生大的荧光关

【技术实现步骤摘要】
可避免细胞内GSH干扰的Cys荧光探针及制备和应用


[0001]本专利技术涉及荧光探针领域，具体涉及一种可避免细胞内GSH干扰的Cys荧光探针及制备和应用。

技术介绍

[0002]线粒体呼吸作用除了为细胞的生存与发展提供能量之外，也会因为呼吸链的电子泄露诱发大量的活性氧(ROS)，主要包括超氧自由基(O2·
‑
)、过氧化氢(H2O2)、次氯酸(HClO)、次溴酸(HBrO)、羟基自由基(HO
·
)。在细胞氧化还原平衡失衡的条件下，过度产生的ROS能够氧化细胞内各种生物大分子，造成细胞正常功能的损伤，最终引发各种各样的疾病。这种倾向于氧化一方的氧化与抗氧化失衡被称为氧化应激(Oxidative Stress)。实际上，为了维持氧化还原平衡，细胞天然表达了各种各样的抗氧系统，其中小分子生物硫醇构成了细胞内重要的抗氧系统之一，在维持细胞内氧化还原平衡方面扮演了关键的角色。其中，半胱氨酸(Cys)是一个重要的生物硫醇。在生物体内，Cys与同型半胱氨酸(Hcy)、谷胱甘肽(GSH)共同维持着生物体内氧化
‑
还原平衡；其次，由于Cys结构中巯基的强亲核能力和配位能力，Cys能与有毒的芳香族化合物缩合成硫醚氨酸，还能与铜、汞等重金属络合，从而起到解毒作用。另外，Cys还参与多种蛋白质的构成，同时还与生物催化、蛋白质的翻译后修饰等生物反应有关。由于这些重要的生理功能，Cys在体内含量的异常将导致严重的疾病发生。
[0003]鉴于此，开发一种生物兼容的、选择性高且敏感的Cys检测方法，不仅对于Cys的各种已知的和未知的生理病理功能的研究，而且对于相关治疗药物的开发均意义重大。
[0004]在各种检测方法中，荧光探针技术由于分析时间短、操作简单、灵敏度高、可视化以及样品的无损性等特点，已是现代生物医学研究不可缺少的工具，在揭示生物活性分子、离子的定位及功能方面发挥了巨大的作用。鉴于此，近十几年来，利用生物硫醇发生的系列特异性化学反应，大量的生物硫醇荧光探针被相继报道。然而，由于Cys与GSH有相似的结构和反应性且细胞内Cys浓度(200
‑
300μM)远低于GSH的浓度(1
‑
10mM)，开发能避免细胞内GSH干扰的Cys荧光探针具有相当的挑战。需要指出的是，尽管同型半胱氨酸(Hcy)与Cys的结构和反应性及其相似(仅差一个
‑
CH2‑
基团)，由于其极低的细胞内浓度(～10μM)，其所造成的干扰通常可以忽略不计。迄今报道的能选择性传感细胞内Cys的荧光探针主要分为如下三类:醛基成环型、加成
‑
环化型和取代
‑
重排型。尽管基于上述三个策略的荧光探针能高选择性荧光传感Cys，但在实际使用时仍存在一些缺点。例如，大部分“醛基成环型”Cys荧光探针的反应性弱、水溶性低，导致了敏感性差、荧光响应时间长、生物兼容性低，而且该类探针的荧光调控机理不明确，设计时难以把握荧光响应的方式；“加成
‑
环化型”和“取代
‑
重排型”Cys荧光探针尽管能避免GSH引发的荧光信号的干扰，但其能被细胞内高浓度的GSH所消耗，导致细胞内探针浓度的降低，因此影响了细胞内Cys的检测敏感性。因此，如何避免这些缺点，尤其是GSH消耗探针的问题，是当前设计Cys荧光探针所面临的重要挑战。硅吡啰红是一类具有高的摩尔消光系数和荧光量子产率、强的pH耐受性、良好的水溶性和光稳定性的近
红外荧光染料。重要的是，硅吡啰红及其衍生物的9号碳原子具有强的电正性，能与亲核试剂发生加成或芳香亲核取代反应。利用该性质，针对上述挑战，本专利技术利用取代反应的可逆性和重排反应的不可逆性，合成了一种可避免GSH干扰的Cys荧光探针SiPyCl。

技术实现思路

[0005]针对上述问题，本专利技术提供了一种可避免GSH干扰的Cys荧光探针及其制备、应用。该探针可与Cys发生“取代
‑
重排”反应，生成一个红荧光的“胺基
‑
硅吡啰红”染料，而与GSH仅发生取代反应，生成一个非荧光的“硫代硅吡啰红”染料。重要的是，SiPyCl与GSH反应后生成的“硫代硅吡啰红”染料能进一步与Cys发生“取代
‑
重排”反应，生成红荧光的“胺基
‑
硅吡啰红”；而且，该反应的效率很高，甚至能在毫摩尔水平GSH的存在下几分钟内完成。因此，无论GSH是否存在，探针SiPyCl均能与Cys反应生成红荧光的“胺基
‑
硅吡啰红”染料。换句话说，SiPyCl是一个可避免GSH干扰的Cys荧光探针。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术采用了下列技术方案：
[0007]一种可避免细胞内GSH干扰的Cys荧光探针，所述探针为SiPyCl，其结构式为：
[0008][0009]一种可避免细胞内GSH干扰的Cys荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
[0010][0011](1)在氮气保护下，将4，4
’‑
亚甲基双(N，N
‑
二甲基苯胺)(化合物1)溶于超干四氢呋喃中，控温
‑
78℃条件下，向上述反应液中逐滴滴入正丁基锂，继续控温反应2小时；在该温度下，向上述反应液中逐渐滴入二氯二甲基硅烷，反应液升至室温并搅拌反应2小时，反应结束后，加入盐酸水溶液以中和反应液，蒸干四氢呋喃，残余液体用乙醚萃取，合并的有机相分别用饱和NaHCO3溶液、水、饱和氯化钠水溶液洗涤，干燥旋干后得二氢硅吡啰红(化合物2)，化合物2无需进行提纯直接进行下一步反应；
[0012](2)将二氢硅吡啰红(化合物2)溶于丙酮中，在冰盐浴下条件控温
‑
15℃，向上述溶液中加入高锰酸钾粉末，反应液恢复到室温继续反应2小时，反应液经过滤、干燥和柱色谱分离后得到硅吡啰红酮(化合物3)为黄色固体；
[0013](3)将硅吡啰红酮(化合物3)溶解在干燥的二氯甲烷中，向上述溶液中逐滴滴加草酰氯，反应液室温搅拌反应10分钟，反应结束后，将溶剂旋干，粗产品经柱色谱分离得所述探针SiPyCl。
[0014]进一步，所述步骤(1)中4，4
’‑
亚甲基双(N，N
‑
二甲基苯胺)、正丁基锂与二氯二甲基硅烷的摩尔比为1：4：1.8。
[0015]进一步，所述步骤(1)中盐酸水溶液的浓度为1mol/L。
[0016]进一步，所述步骤(3)中硅吡啰红酮与草酰氯的摩尔比为1:1.2。
[0017]进一步，所述步骤(3)中柱色谱分离展开剂CH2Cl2：CH3CN的体积比为5:2。
[0018]一种可避免细胞内GSH干扰的Cys荧光探针的应用，在制备检测细胞内Cys试剂中的应用。
[0019]与现有技术相比本专利技术具有以下优点：
[0020]GSH在细胞中的浓度为毫摩尔(1
‑
10mM)水平，目前报道的大部分Cys荧光探针存在易被细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可避免细胞内GSH干扰的Cys荧光探针，其特征在于，所述探针的结构式为：2.一种权利要求1所述可避免细胞内GSH干扰的Cys荧光探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)在氮气保护下，将4，4
’‑
亚甲基双(N，N
‑
二甲基苯胺)溶于超干四氢呋喃中，控温
‑
78℃条件下，向上述反应液中逐滴滴入正丁基锂，继续控温反应2小时；在该温度下，向上述反应液中逐渐滴入二氯二甲基硅烷，反应液升至室温并搅拌反应2小时，反应结束后，加入盐酸水溶液以中和反应液，蒸干四氢呋喃，残余液体用乙醚萃取，合并的有机相分别用饱和NaHCO3溶液、水、饱和氯化钠水溶液洗涤，干燥旋干后得二氢硅吡啰红；(2)将二氢硅吡啰红溶于丙酮中，在冰盐浴下条件控温
‑
15℃，向上述溶液中加入高锰酸钾粉末，反应液恢复到室温继续反应2小时，反应液经过滤、干燥和柱色谱分离后得到硅吡啰红酮；(3)将硅吡啰红酮溶解在干燥的二氯甲烷中，向上述溶液中逐滴滴...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘景，张洪星，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：