一种从猪血中纯化重组人血清白蛋白的方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种从猪血中纯化重组人血清白蛋白的方法及应用。所述方法包括以下步骤：(1)含有人血清白蛋白的猪血上清经阴离子交换层析后，得到第一层析产物；(2)所述第一层析产物经复合型离子交换层析，得到第二层析产物；(3)所述第二层析产物经疏水层析，得到纯化的重组人血清白蛋白。所述方法在阴离子交换层析步骤之前还存在前处理操作，以除去部分杂质。本发明专利技术提供的方法高效，简便，能够得到高纯度的重组人血清白蛋白以应用于临床治疗，且三步层析操作所使用的层析介质已经实现商业化，能够更好地进一步实现工业化，具有重大的现实意义。意义。意义。

【技术实现步骤摘要】
一种从猪血中纯化重组人血清白蛋白的方法及应用


[0001]本专利技术属于生物
，特别涉及一种从猪血中纯化重组人血清白蛋白的方法及应用。

技术介绍

[0002]人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)是由585个氨基酸组成的单链非糖基化的可溶性多肽，分子量为66.6kDa，等电点在4.7
‑
4.9之间。整个单链蛋白分子共有17对二硫键，1个半胱氨酸位点和1个色氨酸位点。HAS作为血浆中含量最丰富的蛋白质，在维持血浆血压、抗凝血等方面发挥重要作用，能够保护和稳定血液中的免疫球蛋白，具有重要的医用价值，在临床上需求量很大。
[0003]目前，临床上使用的HSA主要从人血中进行提取、分离而得到。然而该方法存在着供应原料不足的缺点，且血液本身可能存在携带肝炎病毒或HIV病毒的风险，使得人们对采用血浆中提取的HAS有着巨大的担忧。因此，采用DNA重组技术生产人血清白蛋白得到了开发利用。
[0004]研究人员利用CRISPR/Cas9技术对猪受精卵的基因组进行编辑，在猪白蛋白基因区域插入人血清白蛋白基因，使猪血中只产生重组人血清白蛋白(recombinant human serum albumin,rHSA)，通过纯化猪血浆获得大量高纯度的rHSA。由于转基因猪血中分离纯化的rHSA必须符合临床用药和生化研究的要求，因此，分离纯化rHSA是从转基因猪血中制备rHSA的关键步骤。
[0005]CN112210002A公开了一种重组人血清白蛋白的纯化方法，包括以下步骤：将含重组人血清白蛋白的发酵液依次进行除杂、第一浓缩换液、第一阳离子交换层析、疏水层析、第二浓缩换液、阴离子交换层析、亲和层析、第三浓缩换液和第二阳离子交换层析，经过五步层析纯化后，重组人血清白蛋白的纯度能达到99.97％。但该研究中采用的纯化方法比较复杂，步骤较多。
[0006]CN110092827A公开了一种获得高纯度重组人血清白蛋白的纯化方法，该方法包括：除杂处理和依次进行的阳离子交换层析、阴离子交换层析及疏水层析步骤，得到的重组人血清白蛋白具有纯度高、杂质少、不易降解、稳定性高等优势，具有良好的应用前景。但该研究中的除杂处理包括依次进行的初级超滤、二级超滤、杂质去除、蛋白复性、洗脱及透析步骤，过程较为繁琐，耗时耗力。
[0007]CN102532254A公开了一种从转基因水稻中分离纯化重组人血清白蛋白的方法，依次包括：阳离子交换层析、阴离子交换层析和疏水层析，方法简单易行，经济成本低，获得的重组人血清白蛋白的纯度能够达到99％以上。但该研究中并没有公开从猪血白蛋白中纯化rHSA的方法。
[0008]基于以上研究，得到高纯度的重组人血清蛋白是满足临床用药的关键所在，以上研究虽然都能够得到纯度在99％以上的rHSA，但CN112210002A和CN110092827A都存在着步骤繁琐的问题，CN102532254A虽然分离纯化rHSA的方法简便，但并没有公开从猪血白蛋白
中纯化rHSA的方法，且以上研究采用的均为依次进行阳离子层析、阴离子层析及疏水层析的步骤，没有公开其他的层析操作。
[0009]因此，找到一种高效、简便的从猪血白蛋白中分离、纯化重组人血清白蛋白的方法，获得高纯度的重组人血清白蛋白，对临床治疗和生化研究具有重大的现实意义。

技术实现思路

[0010]针对现有技术的不足和现实的实际需求，本专利技术的目的在于提供一种从猪血中纯化重组人血清白蛋白的方法及应用。所述的方法依次通过阴离子交换层析、复合型离子交换层析和疏水层析得到重组人血清白蛋白，方法高效、简便，得到的重组人血清白蛋白纯度达标，对临床治疗具有重大的现实意义。
[0011]为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0012]第一方面，本专利技术提供一种从猪血中纯化重组人血清白蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：
[0013](1)含有人血清白蛋白的猪血上清经阴离子交换层析后，得到第一层析产物；
[0014](2)所述第一层析产物经复合型离子交换层析，得到第二层析产物；
[0015](3)所述第二层析产物经疏水层析，得到纯化的重组人血清白蛋白。
[0016]本专利技术采用阴离子交换层析，捕获猪血上清中重组人血清白蛋白；随后采用复合型离子交换层析对得到的重组人血清白蛋白进行中度纯化；最终采用疏水层析对中度纯化的重组人血清白蛋白进行精细纯化。
[0017]需要说明的是本专利技术依次采用阴离子交换层析、复合型离子交换层析和疏水层析捕获重组人血清白蛋白并进行纯化，通过三步层析之间的协调复配作用提高纯化效果，最终得到高纯度的重组人血清白蛋白。若改变三步层析之间的顺序将导致纯化效果差，无法得到合格的重组人血清白蛋白样品。
[0018]优选地，步骤(1)所述阴离子交换层析使用的介质为阴离子交换层析介质。
[0019]优选地，所述阴离子交换层析介质包括NanoGel 50Q。
[0020]优选地，步骤(2)所述复合型离子交换层析使用的介质为复合型离子交换层析介质。
[0021]优选地，所述复合型离子交换层析介质包括Agrose HCM。
[0022]优选地，步骤(3)所述疏水层析使用的介质为疏水层析介质。
[0023]优选地，所述疏水层析介质包括聚丙烯。
[0024]本专利技术中采用的NanoGel 50Q层析介质，机械强度优异、化学稳定性好、粒径均一，其以聚苯乙烯/二乙烯基苯微球为基质，通过表面亲水性改性降低非特异性吸附，具有高流速、高分辨率、高载量和低反压的层析优势；Agrose HCM层析介质是在高交联琼脂糖微球上键合了疏水基团和离子基团的复合型离子交换层析介质，具有不同于传统离子交换层析介质的优异选择性；聚丙烯疏水层析介质机械强度高，分辨率高，在高盐条件下吸附生物分子，低盐下洗脱，具有卓越吸附载量和低非特异性吸附，适用于离子交换过程之后产品的继续分离纯化。
[0025]本专利技术中将NanoGel 50Q、Agrose HCM和聚丙烯疏水层析介质联合使用，按照特定顺序使用所述三种层析介质，三者之间协同配合达到洗脱和纯化的效果，最终得到纯度较
高、产量也较高的重组人血清白蛋白。
[0026]优选地，步骤(1)所述阴离子交换层析包括装柱、上样和洗脱。
[0027]优选地，所述阴离子交换层析的具体操作包括：
[0028]将阴离子交换层析介质装柱后得到阴离子交换层析柱，加入缓冲溶液A，随后，加入所述含有人血清蛋白的猪血上清，再向所述阴离子交换层析柱中加入淋洗液，而后，依次加入洗脱液A和洗脱液B进行一次洗脱和二次洗脱，收集所述二次洗脱后的液体作为第一层析产物。
[0029]优选地，所述缓冲溶液A包括磷酸缓冲溶液。
[0030]优选地，所述淋洗液包括含有氯化钠的磷酸缓冲溶液。
[0031]所述淋洗液可以改善选择性，洗脱部分杂质，方便产品后续的分离、纯化。
[0032]优选本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种从猪血中纯化重组人血清白蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)含有人血清白蛋白的猪血上清经阴离子交换层析后，得到第一层析产物；(2)所述第一层析产物经复合型离子交换层析，得到第二层析产物；(3)所述第二层析产物经疏水层析，得到纯化的重组人血清白蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述阴离子交换层析使用的介质为阴离子交换层析介质；优选地，所述阴离子交换层析介质包括NanoGel 50Q；优选地，步骤(2)所述复合型离子交换层析使用的介质为复合型离子交换层析介质；优选地，所述复合型离子交换层析介质包括Agrose HCM；优选地，步骤(3)所述疏水层析使用的介质为疏水层析介质；优选地，所述疏水层析介质包括聚丙烯。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述阴离子交换层析包括装柱、上样和洗脱；优选地，所述阴离子交换层析的具体操作包括：将阴离子交换层析介质装柱后得到阴离子交换层析柱，加入缓冲溶液A，随后，加入所述含有人血清蛋白的猪血上清，再向所述阴离子交换层析柱中加入淋洗液，而后，依次加入洗脱液A和洗脱液B进行一次洗脱和二次洗脱，收集所述二次洗脱后的液体作为第一层析产物；优选地，所述缓冲溶液A包括磷酸缓冲溶液；优选地，所述淋洗液包括含有氯化钠的磷酸缓冲溶液；优选地，所述一次洗脱采用洗脱液A，所述洗脱液A包括含有氯化钠的磷酸缓冲溶液；优选地，所述洗脱液A中的氯化钠溶液的电导率为19～21mS/cm，优选为19.5～20.5mS/cm，进一步优选为19.8mS/cm；优选地，所述二次洗脱采用洗脱液B，所述洗脱液B包括含有氯化钠的磷酸缓冲溶液；优选地，所述洗脱液B中的氯化钠溶液的摩尔浓度为0.8～1.2M，优选为0.9～1.1M，进一步优选为1M；优选地，所述缓冲溶液A、淋洗液、洗脱液A和洗脱液B的pH值相同或不同，所述pH值为7.2～7.6，优选为7.3～7.5，进一步优选为7.4；优选地，所述缓冲溶液A、淋洗液、洗脱液A和洗脱液B的pH值相同。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述复合型离子交换层析包括装柱、上样和洗脱；优选地，所述复合型离子交换层析的具体操作包括：将复合型离子交换层介质装柱后得到复合型离子交换层柱，加入缓冲溶液B，随后，加入所述第一层析产物，而后，加入洗脱液C进行洗脱，收集所述洗脱后的液体作为第二层析产物；优选地，所述复合型离子交换层析中的洗脱为等度洗脱；优选地，所述缓冲溶液B包括磷酸缓冲溶液；优选地，所述洗脱液C为含有氯化钠溶液的磷酸缓冲溶液；优选地，所述缓冲溶液B和洗脱液C的pH值相同或不同，所述pH值为5.7～6.3，优选为
5.8～6.2，进一步优选为6；优选地，所述缓冲溶液B和洗脱液C的pH值相同。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述疏水层析包括装柱、上样和洗脱；优选地，所述疏水层析的具体操作包括：将疏水层析介质装柱后得到疏水层析柱，加入缓冲溶液C，随后，加入所述第二层析产物，而后，加入洗脱液D进行洗脱，收集所述洗脱后的液体，得到所述纯化的重组人血清白蛋白；优选地，所述疏水层析中的洗脱为梯度洗脱；优选地，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵传博，金百胜，
申请(专利权)人：常熟纳微生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：