一种利用西洋参内生菌发酵制备溶栓酶的方法技术

本发明专利技术从西洋参中分离出一株产溶栓酶的菌株——枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis sp.)CG1(保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072，保藏日期为2020年6月19日，保藏编号为CCTCC NO：M2020225)。菌株CG1的最佳产酶发酵条件为：温度32℃、时间37h、转速187r/min，在此发酵条件下，溶栓酶活力最大可达917.35IU/mL。纯化后的溶栓酶在3

【技术实现步骤摘要】
一种利用西洋参内生菌发酵制备溶栓酶的方法


[0001]本专利技术涉及溶栓酶发酵领域，尤其是一种利用西洋参内生菌——枯草芽孢杆菌CG1(Bacillussubtilis CG1)发酵制备溶栓酶的方法。

技术介绍

[0002]血栓性疾病是因为血液中纤维蛋白的不断堆积所造成的血管腔狭窄与闭塞，使体内出现缺血和梗塞而引发的功能障碍疾病，具有多发性，隐匿性，其致死率及其复发率极高。近年来，微生物源溶栓酶因其在血栓治疗中的潜在应用而受到广泛关注。
[0003]植物内生菌是一类特殊而重要的微生物，可产生大量具有多种生物学功能的代谢产物，可作为抗菌、降糖、抗癌和免疫抑制药物的良好来源，具有潜在的药用价值。西洋参(Panax quinquefolius L.)是名贵中药材，具有广泛的药理作用，涉及抗肿瘤、抗血糖、抗血栓、免疫调节、调节神经、抗氧化、抗疲劳等方面，其内生菌资源丰富，定植在健康西洋参组织中，但目前研究较少，且有关西洋参内生菌来源的溶栓酶研究未见报道。
[0004]本专利技术从西洋参中分离出一株高产溶栓酶的菌株，通过对其进行菌种鉴定，发酵工艺优化，并对其所产溶栓酶进行分离纯化和酶学性质研究，发现该菌株发酵所产溶栓酶活力高，对酸、碱、热稳定性好，最适温度和pH与人体的生理条件接近，可以适应人体的温度环境和胃酸环境，适合开发成口服溶栓药物；Mn2+、 Mg2+对酶活性具有显著的激活作用，是一种金属丝氨酸蛋白酶。该酶的作用方式为直接溶解纤维蛋白，不能激活溶栓酶原间接溶解纤维蛋白，可有效避免由溶栓酶原激活剂引起的出血和溶栓亢进等副作用，这是该酶相对于临床上使用的溶栓酶原激活剂的一个特殊优势，有作为功能性食品或临床溶栓剂开发的潜力。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是从西洋参中分离出一株产溶栓酶的菌株——枯草芽孢杆菌 CG1(Bacillussubtilis CG1)及其在溶栓酶发酵中的应用。
[0006]本专利技术所采用的技术方案是：
[0007]枯草芽孢杆菌CG1(Bacillussubtilis CG1)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072，保藏日期为2020年6月19 日，保藏编号为CCTCCNO：M2020225；该菌株的主要生物学特征为：CG1接种在NA平板培养24h后，菌落呈白色，圆形，菌落不透明，边缘整齐，表面褶皱，菌落中央有突起；菌株呈单个菌体，直杆状且两端钝圆；革兰氏染色阳性；溶菌酶试验阴性、过氧化氢酶试验阳性；MR试验阴性，VP试验阳性；可利用葡萄糖、麦芽糖、木糖、甘露醇和山梨醇，不能利用乳糖、棉子糖和鼠李糖；能水解七叶苷、淀粉、尿素、果胶和明胶；能利用丙二酸盐和西蒙氏盐，并能还原硝酸盐。CG1可高效产溶栓酶，在温度32℃、时间37h、转速187r/min的产酶发酵条件下酶活力可达917.35IU/mL，纯化后的溶栓酶在3
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12pH范围内均具有活性，30
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45℃温度范围内稳定性良好，最适温度在40
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45℃左右，最适pH在 7.5左右；Mn 2+、Mg 2+对酶活性具有显著的激活作用，是一种金属丝氨酸
蛋白酶。该酶的活性高，作用方式为直接溶解纤维蛋白，不能激活溶栓酶原间接溶解纤维蛋白，可有效避免由溶栓酶原激活剂引起的出血和溶栓亢进等副作用。该菌株经16S rDNA序列分析鉴定为Bacillus subtilis属，命名为枯草芽孢杆菌 CG1(Bacillus subtilis CG1)，Genbank登陆号为MK208685.1。
[0008]所述菌株CG1的分离方法按如下步骤操作：
[0009](1)菌株分离：取西洋参鲜根，去除须根，自来水冲洗5min，用滤纸吸干水分后，用75％乙醇浸泡1min，后用2％NaClO浸泡4min，再用50％乙醇冲洗30s，然后用无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干根部表面水分，用无菌剪刀去除表皮及边缘组织后，剪成0.3cm
×
0.3cm的小块，等间距接入NA、PDA培养基中，分别于37℃、28℃恒温培养箱中倒置培养；
[0010](2)菌株纯化和保藏：待根块边缘长出菌落后，挑取单菌落或孢子，接种于新的平板上培养，如此重复6次，得到单一菌落的内生菌平板；将分离纯化得到的内生菌接种至对应的斜面培养基中，待菌落完全长出后，保存于4℃冰箱；
[0011](3)菌株筛选
[0012]初筛：将西洋参内生菌点在初筛平板上，28℃培养2
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4天，选取产生透明圈的菌株用于复筛；所述初筛平板为脱脂奶粉50.0g/L溶于蒸馏水中，115℃灭菌 15min；琼脂粉15.0g/L溶于蒸馏水中，121℃灭菌20min，冷却后混合均匀，取 20mL倒入平板凝固而成；
[0013]复筛：将初筛选出的菌株用接种环挑取单菌落接种至装有50mL种子培养基的150mL三角瓶中，30℃、180r/min恒温震荡培养12h，制备种子液；取2％ (v/v)种子液接种至装有50mL发酵培养基的150mL三角瓶中，30℃恒温震荡培养48h，发酵液在4℃、10000r/min条件下离心10min，取上清液备用；用直径3mm的打孔器打孔纤维蛋白平板，取10uL上清液注入孔中，以无菌生理盐水做对照，将纤维蛋白平板置于37℃恒温培养箱孵育18h后取出观察是否有透明圈产生，根据透明圈直径计算发酵液溶栓酶活力，筛选获得产溶栓酶的菌株。
[0014]利用所述菌株CG1发酵制备溶栓酶按如下步骤操作：
[0015](1)斜面培养：将菌株CG1接种于牛肉膏蛋白胨(NA)培养基中，于37℃恒温培养24
‑
48h，待菌落完全长出后，获得菌体斜面；
[0016](2)种子培养：从步骤(1)菌体斜面上挑取菌体接种至种子培养基中恒温震荡培养12
‑
18h，制得CG1种子液；
[0017](3)发酵产酶：将步骤(2)获得的种子液接入发酵培养基中；于28
‑
38℃， 150
‑
200r/min的条件下，震荡发酵培养32
‑
42h，获得CG1溶栓酶粗酶液。
[0018]作为优选，利用所述菌株CG1发酵制备溶栓酶按如下步骤操作：
[0019](1)斜面培养：将菌株CG1接种于牛肉膏蛋白胨(NA)培养基中，于37℃恒温培养37h，待菌落完全长出后，获得菌体斜面；
[0020](2)种子培养：从步骤(1)菌体斜面上挑取菌体接种至种子培养基中恒温震荡培养15h，制得CG1种子液；
[0021](3)发酵产酶：将步骤(2)获得种子液接入发酵培养基中，于32℃，187 r/min的条件下，震荡培养37h，获得CG1溶栓酶粗酶液。
[0022]所述溶栓酶的分离纯化工艺按如下步骤操作：
[0023](1)硫酸盐沉淀：取100mL粗酶液缓缓添加硫酸铵固体至终饱和度为30％，在冰浴条件下用磁力搅拌器低速搅拌，待硫酸铵固体充分本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株产溶栓酶的菌株——枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilissp.)CG1，分离自西洋参根部，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072，保藏日期为2020年6月19日，保藏编号为CCTCC NO：M2020225。2.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilissp.)CG1的分离方法，其特征在于，按如下步骤操作：(1)菌株分离：取西洋参鲜根，去除须根，自来水冲洗5min，用滤纸吸干水分后，用75％乙醇浸泡1min，后用2％NaClO浸泡4min，再用50％乙醇冲洗30s，然后用无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干根部表面水分，用无菌剪刀去除表皮及边缘组织后，剪成0.3cm
×
0.3cm的小块，等间距接入NA、PDA培养基中，分别于37℃、28℃恒温培养箱中倒置培养；(2)菌株纯化和保藏：待根块边缘长出菌落后，挑取单菌落或孢子，接种于新的平板上培养，如此重复6次，得到单一菌落的内生菌平板；将分离纯化得到的内生菌接种至对应的斜面培养基中，待菌落完全长出后，保存于4℃冰箱；(3)菌株筛选初筛：将西洋参内生菌点在初筛平板上，28℃培养2
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4天，选取产生透明圈的菌株用于复筛；所述初筛平板为脱脂奶粉50.0g/L溶于蒸馏水中，115℃灭菌15min；琼脂粉15.0g/L溶于蒸馏水中，121℃灭菌20min，冷却后混合均匀，取20mL倒入平板凝固而成；复筛：将初筛选出的菌株用接种环挑取单菌落接种至装有50mL种子培养基的150mL三角瓶中，30℃、180r/min恒温震荡培养12h，制备种子液；取2％(v/v)种子液接种至装有50mL发酵培养基的150mL三角瓶中，30℃恒温震荡培养48h，发酵液在4℃、10000r/min条件下离心10min，取上清液备用；用直径3mm的打孔器打孔纤维蛋白平板，取10uL上清液注入孔中，以无菌生理盐水做对照，将纤维蛋白平板置于37℃恒温培养箱孵育18h后取出观察是否有透明圈产生，根据透明圈直径计算发酵液溶栓酶活力，筛选获得产溶栓酶的菌株。3.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilissp.)CG1在发酵制备溶菌酶中的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的应用按如下步骤操作：(1)斜面培养：将菌株CG1接种于牛肉膏蛋白胨(NA)培养基中，于37℃恒温培养24
‑
48h，待菌落完全长出后，获得菌体斜面；(2)种子培养：从步骤(1)菌体斜面上挑取菌体接种至种子培养基中恒温震荡培养12
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18h，制得CG1种子液；(3)发酵产酶：将步骤(2)获得的种子液接入发酵培养基中，于28
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38℃，150
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200r/min的条件下，震荡发酵培养32
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42h，获得CG1溶栓酶粗酶液。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的应用按如下步骤操作：(1)斜面培养：将菌株CG1接种于牛肉膏蛋白胨(NA)培养基中，于37℃恒温培养37h，待菌落完全长出后，获得菌体斜面；(2)种子培养：从步骤(1)菌体斜面上挑取菌体接种至种子培养基中恒温震荡培养15h，制得CG1种子液；(3)发酵产酶：将步骤(2)获得种子液接入发酵培养基中，于32℃，187r/min的条件...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱大恒，郭敏，谷萌萌，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：