本发明专利技术公开了一种甲型肝炎病毒特异性纳米抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示。本发明专利技术的纳米抗体对甲型肝炎病毒具有特异的识别和结合能力，可用于甲型肝炎病毒检测试剂的研发以及抗甲型肝炎病毒药物的制备，解决了现有甲型肝炎病毒检测技术的不足，具有广阔的临床应用前景。临床应用前景。临床应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一种甲型肝炎病毒特异性纳米抗体及其应用
[0001]本专利技术涉及一种甲型肝炎病毒特异性纳米抗体及其应用，属于生物医药
技术介绍
[0002]甲型肝炎病毒属微小RNA病毒科、嗜肝病毒属的病毒，是甲型肝炎(以下简称甲肝)的病原体。接种甲肝疫苗是预防和控制甲肝流行的最有效措施。甲型肝炎灭活疫苗的效价检测多采用体内效力方法，但体内效力试验需免疫动物后观察攻毒保护效果或检测抗体，存在操作时间长，实验结果波动大等缺陷以及动物伦理方面的限制。随着科技的进步以及对操作便利性、检测结果准确性和重复性等要求的提高，逐渐建立了细胞法、免疫法、生化和理化等体外效价检测方法，《中国药典》中灭活甲肝疫苗已应用体外免疫学方法替代体内效力检测。甲肝灭活疫苗的效价检测是以病毒滴度(活菌数)为指标的体外效力检测，采用的是传统酶联免疫方法(ELISA)，但其中所这涉及的单克隆抗体制备还存在很大挑战，也给检测方法带来很大程度上的不稳定性。因此，迫切需要寻找传统抗体的替代抗体，以克服基于单克隆抗体进行甲肝灭活疫苗的效价检测所带来的不足。
[0003]1989年，比利时免疫学家Hamers
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Casterman在分离骆驼血清中的抗体时偶然发现一种天然缺失轻链的重链抗体，该抗体只包含1个重链可变区(VHH) 和2个常规的CH2与CH3区，重链可变区具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，其分子质量只有单克隆抗体的1/10，是迄今为止获得的结构稳定且具有抗原结合活性的最小抗体单位，因此也被称纳米抗体。与传统单克隆抗体片段相比，纳米抗体可溶性极高，不易发生聚集沉淀，具有很高的稳定性，能够在高温、强酸、强碱等致变性条件下保持抗原结合活性，并且具有特异性强、免疫原性弱的特点。目前，纳米抗体被广泛应用于开发治疗性抗体药物、诊断试剂(胶体金法、酶联免疫吸附法、电化学发光法)、亲和纯化基质、免疫学研究等基础科学研究领域。
技术实现思路
[0004]本专利技术的目的在于针对现有技术中甲型肝炎病毒检测技术存在的不足，提供一种甲型肝炎病毒特异性纳米抗体，并公开其编码序列。
[0005]技术方案
[0006]一种甲型肝炎病毒特异性纳米抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7 或SEQ ID NO.8所示。
[0007]本专利技术人采用甲型肝炎病毒免疫内蒙古阿拉善双峰驼，提取外周血淋巴细胞总RNA并将其反转录成cDNA，再将通过巢氏PCR技术扩增目的基因，利用噬菌体展示技术构建高质量的噬菌体展示文库，进行文库亲和淘选，最终筛选获得特异性较好的甲型肝炎病毒纳米抗体。
[0008]本专利技术提供了上述纳米抗体在制备检测甲型肝炎病毒的试剂中的应用。
[0009]本专利技术提供了上述纳米抗体在制备预防或治疗甲型肝炎病毒感染的药物中的应用。
[0010]一种用于检测甲型肝炎病毒的试剂盒，所述试剂盒中包含上述甲型肝炎病毒特异性纳米抗体。
[0011]本专利技术的有益效果：
[0012]本专利技术提供了一种甲型肝炎病毒特异性纳米抗体，其对甲型肝炎病毒具有特异的识别和结合能力。该纳米抗体可用于甲型肝炎病毒检测试剂的研发以及抗甲型肝炎病毒药物的制备，具备广阔的临床应用前景。
附图说明
[0013]图1为甲型肝炎病毒特异性纳米抗体基因的PCR扩增产物的电泳图；
[0014]图2为纳米抗体HAV
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a、HAV
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b、HAV
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c、HAV
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e、HAV
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g、HAV
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h、HAV
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j、 HAV
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k的SDS
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PAGE检测结果；
[0015]图3为纳米抗体HAV
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a的纯度的SEC
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HPLC检测结果；
[0016]图4为纳米抗体HAV
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b的纯度的SEC
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HPLC检测结果；
[0017]图5为纳米抗体HAV
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c的纯度的SEC
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HPLC检测结果；
[0018]图6为纳米抗体HAV
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e的纯度的SEC
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HPLC检测结果；
[0019]图7为纳米抗体HAV
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g的纯度的SEC
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HPLC检测结果；
[0020]图8为纳米抗体HAV
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h的纯度的SEC
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HPLC检测结果；
[0021]图9为纳米抗体HAV
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j的纯度的SEC
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HPLC检测结果；
[0022]图10为纳米抗体HAV
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k的纯度的SEC
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HPLC检测结果。
具体实施方式
[0023]为使本专利技术实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合附图和具体实施方式，进一步阐述本专利技术。
[0024]实施例1
[0025]针对甲型肝炎病毒的纳米抗体文库的构建：
[0026](1)使用0.5ml甲型肝炎病毒灭活疫苗(采购自艾美康淮生物制药(江苏) 有限公司)免疫一只双峰驼，每周一次，共连续免疫7次。第8周采集双峰驼静脉血100ml。将Ficoll试剂按1：1加入静脉血，并在400g条件下离心30分钟，然后用滴管取出中间双峰驼白色淋巴细胞层，用宝生物工程(大连)有限公司 Total RNA kit提取总RNA；
[0027](2)采用宝生物工程(大连)有限公司Takara逆转录试剂盒，进行总RNA 的反转录，得到cDNA。
[0028](3)以cDNA为模板，以F/R序列为引物，其中，上游引物F1： 5'
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CTGGGTGGTCCTGGCTGCTCTT
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3'、下游引物R1： 5'
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GCGGTACGTGTGTTGAACTGTT
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3'，通过巢氏PCR技术扩增VHH目的基因 (重链抗体可变区)，利用限制性内切酶分别酶切pMECS载体和VHH片段，然后将酶切后的片段和载体链接，得到重组载体。胶回收得到750bp的目标片段 PCR产物。
[0029](4)将重组载体电转化至电转感受态细胞TG1中，得到重组TG1细胞，构建HAV纳米抗体文库，库容大小为1
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109。进行菌落PCR检测，结果表明所建文库的插入率在80％以上，证明VHH有效插入载体。
[0030]实施例2
[0031]针对甲型肝炎病毒的纳米抗体的筛选；
[0032]1)取500ul重组TG1细胞至2
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TY培养基中培养，期间加入100ul辅助噬菌体本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种甲型肝炎病毒特异性纳米抗体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示。...
【专利技术属性】
技术研发人员：叶华跃，彭福中，吴宏斌，王永智，雷高新，施小明，曹蕾，
申请(专利权)人：江苏华创医药研发平台管理有限公司，
类型：发明
国别省市：
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