基于金纳米粒子的比色适配体传感检测大米中真菌毒素的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于金纳米粒子的比色适配体传感检测大米中真菌毒素的方法，向金纳米粒子水溶液中加入真菌毒素适配体水溶液，进行孵育，然后加入待测样品溶液，进行孵育，最后加入氯化钠水溶液进行孵育，观察溶液颜色变化，测定不同溶液在620 nm和520 nm处的紫外吸收值，计算这两者的紫外吸收值的比值A

【技术实现步骤摘要】
基于金纳米粒子的比色适配体传感检测大米中真菌毒素的方法


[0001]本专利技术涉及一种基于金纳米粒子的比色适配体传感检测大米中多种真菌毒素（赭曲霉毒素A和黄曲霉毒素B1）的方法，属于生物毒素检测


技术介绍

[0002]黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物，是毒性最强的真菌毒素之一，具有极强的致癌性、致畸性、致突变性的真菌毒素，广泛分布于自然界，其中以黄曲霉毒素B1（AFB1）毒性最强，会导致急性癌症、肝损伤和肝硬化。赭曲霉毒素是继黄曲霉毒素后又一个引起世界广泛关注的霉菌毒素，它是由曲霉属的7种曲霉和青霉属的6种青霉菌产生的一组重要的、污染食品的真菌毒素，赭曲霉毒素包括7种结构类似的化合物，其中毒性最大、分布最广、产毒量最高、对农产品的污染最重、与人类健康关系最密切的是赭曲霉毒素A (OTA），在霉变谷物、饲料等中最常见。
[0003]目前检测赭曲霉毒素A和黄曲霉毒素B1的方法有液相色谱法、气相色谱法、质谱法和毛细管电泳法、基于抗原抗体反应的免疫学方法等，这些方法可以获得准确和灵敏的结果，但需要繁琐的样品预处理和训练有素的人员。此外，昂贵和复杂的仪器也限制了这些方法在快速检测中的应用。金纳米颗粒（AuNPs）具有特殊的光学特性，在最大吸收波长处具有局部表面等离子体共振（LSPR）效应，在电解质溶液（高浓度NaCl）中能引起相应颜色变化，因此，在比色检测赭曲霉毒素A和黄曲霉毒素B1方面有相关的报道。
[0004]CN107991293A公开了一种用于黄曲霉毒素B1的可视化检测方法，将疏基化黄曲霉毒素B1适配体DNA1和疏基化适配体的互补链DNA2分别与纳米金连接形成适配体
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纳米金探针和互补链
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纳米金探针，利用竞争法：当待测物中含有靶标时，靶标与适配体结合，适配体
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纳米金探针和互补链
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纳米金探针呈游离状态，在高盐浓度下，纳米金易发生聚集，颜色由红色变蓝色；当待测物中不含靶标时，在高盐浓度下，纳米金不发生聚集，颜色仍为红色；随着靶标浓度增大，纳米金颜色由红色渐变为蓝色，通过测定溶液在200～800 nm的紫外
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可见光谱，即可实现对待测物中黄曲霉毒素B1的定量检测。该方法虽然取得了良好的检测结果，但这种方法构建适配体比色传感器步骤较为复杂，需要互补探针的参与。
[0005]曾宪冬等报道了一种基于核酸适配体
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金纳米粒子比色传感器快速检测食品中赭曲霉毒素 A的方法（曾宪冬, 曾灼祥, 陈兴会. 基于核酸适配体
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金纳米粒子比色传感器快速检测食品中赭曲霉毒素A[J]. 食品安全导刊, 2018.），该研究基于核酸适配体作为生物识别元件，金纳米粒子作为比色探针，建立了一种适用于 OTA 检测的比色适配体传感器。该方法通过两条末端巯基化且与 OTA 核酸适配体部分互补的DNA链对金纳米粒子进行功能化处理，OTA 核酸适配体链作为连接链，与两条部分互补链杂交，使功能化的金纳米粒子发生聚集，当溶液中加入 OTA 时，OTA与核酸适配体的结合使其 DNA 构象发生改变，从而造成适配体链与互补的 DNA 链发生解链，团聚的金纳米粒子由于静电作用重新分散于溶液中，颜色由蓝紫色变成红色。该方法检测的灵敏度还需进一步提升。
[0006]CN107723347A公开了一种测定赭曲霉毒素A的超灵敏比色传感检测方法，该方法借助于赭曲霉毒素A适配体特异性识别赭曲霉毒素A分子，从而使得与适配体部分碱基互补的DNA分子解离下来，以解离下的DNA分子为模板，并以与模板互补的金纳米粒子修饰的两种DNA分子和与模板序列相同的两种DNA分子为探针，通过连接酶链式反应进行扩增，在不同浓度赭曲霉毒素A的条件下，随着赭曲霉毒素A浓度的增加，解离下的用于连接酶链式反应的模板DNA分子越多，则DNA探针修饰的金纳米粒子的组装程度越大，金纳米粒子颜色越深，根据赭曲霉毒素A的浓度与紫外吸收比值A
620
/A
520
的对应关系，从而对赭曲霉毒素A的含量进行检测。该方法虽然取得了良好的检测结果，但这种方法构建适配体比色传感器步骤复杂，需要扩增过程，花费时间长，限制了其现场应用。

技术实现思路

[0007]针对现今检测赭曲霉毒素A和黄曲霉毒素B1的适配体比色方法存在的不足，本专利技术提供了一种基于金纳米粒子的比色适配体传感检测大米中真菌毒素的方法，尤其是检测赭曲霉毒素A和黄曲霉毒素B1的方法，该方法无需对检测的样品进行复杂的前处理，不需要借助复杂大型的仪器，核酸适配体无需标记，只需把合成好的适配体直接与纳米金吸附结合，然后加入待测样品和高浓度的盐，孵育后即可检测，操作简单。本方法可以应用于现场快速筛查，检测结果灵敏度高、检测限低，且现象直观，既可以通过颜色的变化进行定性的检测，又可以进行定量的检测，不需要专业的仪器操作人员，降低了检测成本，提高了检测的效率，可实现对OTA和AFB1的快速检测。
[0008]本专利技术具体技术方案如下：一种基于金纳米粒子的比色适配体传感检测大米中真菌毒素的方法，该方法包括以下步骤：（1）向金纳米粒子（AuNPs）水溶液中加入真菌毒素的适配体水溶液，进行孵育，然后分别加入不同浓度的真菌毒素溶液，进行孵育，最后加入氯化钠水溶液进行孵育，观察溶液颜色变化，测定不同溶液在620 nm和520 nm处的紫外吸收值，计算紫外吸收值的比值A
620 nm
/A
520 nm
；（2）以真菌毒素浓度为横坐标，以对应的A
620 nm
/A
520 nm
为纵坐标，绘制标准曲线；（3）将待测的大米样品粉碎，用甲醇进行萃取，然后离心取上清液，将上清液用甲醇稀释，得待检样品溶液；（4）按照步骤（1）的方式，将真菌毒素溶液替换为待检样品溶液，向金纳米粒子（AuNPs）水溶液中加入真菌毒素的适配体水溶液，进行孵育，然后加入待检样品溶液，进行孵育，最后加入氯化钠水溶液进行孵育，观察溶液颜色变化，测定不同溶液在620 nm和520 nm处的紫外吸收值，计算紫外吸收值的比值A
620 nm
/A
520 nm
；（5）将待检样品的A
620 nm
/A
520 nm
比值带入标准曲线，计算得到待检样品中真菌毒素的含量。
[0009]进一步的，所述真菌毒素优选为赭曲霉毒素A（OTA）或黄曲霉毒素B1（AFB1）。不同的真菌毒素在检测时选择与之相适应的适配体。
[0010]进一步的，步骤（1）和（4）中，当真菌毒素为赭曲霉毒素A时，赭曲霉毒素A的适配体为5
’
端巯基化的适配体，其核苷酸序列为：5
’
SH
‑
GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGA
CA
‑3’
，如SEQ ID NO：1所示；当真菌毒素为黄曲霉毒素B1时，黄曲霉毒素B1的适配体为5...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于金纳米粒子的比色适配体传感检测大米中真菌毒素的方法，其特征是，所述真菌毒素为包括以下步骤：（1）向金纳米粒子水溶液中加入真菌毒素的适配体水溶液，进行孵育，然后分别加入不同浓度的真菌毒素溶液，进行孵育，最后加入氯化钠水溶液进行孵育，观察溶液颜色变化，测定不同溶液在620 nm和520 nm处的紫外吸收值，计算紫外吸收值的比值A
620 nm
/A
520 nm
；（2）以真菌毒素浓度为横坐标，以对应的A
620 nm
/A
520 nm
为纵坐标，绘制标准曲线；（3）将待测的大米样品粉碎，用甲醇进行萃取，然后离心取上清液，将上清液用甲醇稀释，得待检样品溶液；（4）按照步骤（1）的方式，将真菌毒素溶液替换为待检样品溶液，观察溶液颜色的变化，测定620 nm和520 nm处的紫外吸收值，得到待检样品的A
620 nm
/A
520 nm
比值；（5）将待检样品的A
620 nm
/A
520 nm
比值带入标准曲线，计算得到待检样品中真菌毒素的含量。2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：所述真菌毒素包括赭曲霉毒素A、黄曲霉毒素B1。3.根据权利要求2所述的方法，其特征是：赭曲霉毒素A的适配体为5
’
端巯基化的适配体，其核苷酸序列为：5
’ꢀ
SH
‑
GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA
‑3’
；黄曲霉毒素B1核苷酸序列为5
’
端巯基化的适配体，其核苷酸序列为：5
’ꢀ
SH
‑
GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA
‑3’<...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹宏梅，李瑞，李林芝，黄添增，
申请(专利权)人：海南大学，
类型：发明
国别省市：