检测KRAS基因突变、ADAMTS1与BNC1甲基化的引物探针，试剂盒与方法技术

本发明专利技术公开了检测KRAS基因突变、ADAMTS1与BNC1甲基化的引物探针，试剂盒与方法，包括相应靶标基因的选择，这里的靶标基因为KRAS及其7种突变型(G12D,G12V,G12C,G12A,G12R,G13D),表观遗传相关的为ADAMTS1与BNC1基因的甲基化，三个靶基因的组合，KRAS突变检测采取的技术为深度测序技术，本发明专利技术通过设计与优化三个基因的引物与探针组合；优化PCR相关mix及Tm值，发明专利技术了一种联合使用KRAS，ADAMTS1与BNC1三个基因靶标来检测者胰腺癌中相应基因突变的试剂盒，本发明专利技术对KRAS基因及相关突变，ADAMTS1与BNC1的甲基化特异性高，灵敏度好，价格低廉，非常适合筛查胰腺癌高危人群的基因突变，因此有高的社会效率与经济效率。因此有高的社会效率与经济效率。因此有高的社会效率与经济效率。

【技术实现步骤摘要】
检测KRAS基因突变、ADAMTS1与BNC1甲基化的引物探针，试剂盒与方法


[0001]本专利技术属于基因检测
，更具体地，涉及一种检测灵敏度高，节省样本量与试剂盒成本，提高成功率的检测KRAS基因突变、ADAMTS1与BNC1甲基化的引物探针，试剂盒与方法。

技术介绍

[0002]胰腺导管腺癌是最致命的恶性肿瘤之一，其总体5年生存率约为5％。只有15
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20％的患者接受手术切除；由于胰腺特殊的结构特征和疾病早期的非典型性症状，另外80％
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85％的患者在诊断时，已经发展成转移性或局部晚期胰腺癌，在影像学检查中偶然诊断为非相关疾病的胰腺癌患者比有症状的患者有更长的中位生存时间，这些数据表明，早期发现癌症是改善这种侵袭性疾病预后的关键问题。Yachida等人报道了从胰腺开始突变到转移性胰腺癌发展的时间大约是21年，这为胰腺癌的早期发现提供了一个广阔的窗口。既往研究证实了早期检测对胰腺癌患者预后的关键作用。筛查高危人群，识别胰腺癌前病变，发现新的生物标志物，可以帮助医生在早期识别患者，从而极大改善胰腺癌的5年生存率。
[0003]在胰腺癌中，原癌基因KRAS的突变是在前驱病变和大多数肿瘤中发现的早期驱动突变，根据《癌症体细胞突变目录》(COSMIC)数据库，截至2016年1月，KRAS突变在所有组织学亚型数据库中的患病率为57％，胰腺癌中，KRAS 12号染色体上的GGT密码子突变最为突出，G12D占29％，G12V占18％，G12C占2％，在其他癌种中还有G12A，G12R与13号染色体上G13D的突变。在腺癌患者中，KRAS突变的患病率(65％)明显高于神经内分泌肿瘤患者(2％)。在慢性良性胰腺炎中KRAS突变发生率为18％，这可能已经是胰腺癌的前兆病变，所以KRAS可以作为胰腺癌肿瘤的早诊的标志物之一。
[0004]胰腺癌的特征是多重遗传和表观遗传的改变。近年来的研究表明，胰腺癌既是一种DNA突变的疾病，也是一种表观遗传学失调的疾病。特别是，DNA启动子甲基化模式的改变可能在肿瘤发生和癌症进展中发挥关键作用。为了解决临床诊断和治疗的需要，许多研究已经使用DNA甲基化分析的特定基因，在多种癌症诊断中应用。原则上，这种诊断测试可用于早期检测、评估预后、作为治疗反应的预测因子和治疗靶点。早期发现疾病可以改善大多数癌症的临床结果。最近，已有多个成功的DNA甲基化筛查的报道，使用不同的体液，如粪便检测结直肠癌和，痰检测肺癌，尿液检测前列腺癌。然而，目前没有筛查工具可以用于胰腺癌的早期检测。
[0005]随着表观遗传变化在胰腺癌中作用的研究和已经公开发表文献的研究，表明胰腺癌中普遍存在甲基化的变化。在综合阅读大量文献后，专利技术人选择了两种生物标志物ADAMTS1(一种具有血栓反应蛋白基型的解整合素和金属蛋白酶1)和BNC1(锌指蛋白basonuclin
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1)作为血液中胰腺癌早期检测的高度敏感标志物，在先前对选定的胰腺癌患者的研究中，有报道称，这两种基因在非侵入性液体中的灵敏度和特异性分别为81％和85％。

技术实现思路

[0006]针对目前市场上未出现专用于检测胰腺癌早期基因突变的方法与产品，本专利技术提供了一种检测KRAS基因突变、ADAMTS1与BNC1甲基化的引物探针，试剂盒与方法。
[0007]包括相应靶标基因的选择，这里的靶标基因为KRAS及其7种突变型(G12D,G12V,G12C,G12A,G12R,G13D),表观遗传相关的为ADAMTS1与BNC1基因的甲基化，三个靶基因的组合，KRAS突变检测采取的技术为深度测序技术，本专利技术通过设计与优化三个基因的引物与探针组合；优化PCR相关mix及Tm值，专利技术了一种联合使用KRAS、ADAMTS1与BNC1三个基因靶标来检测者胰腺癌中相应基因突变的试剂盒，本专利技术对KRAS基因及相关突变，ADAMTS1与BNC1的甲基化特异性高，灵敏度好，价格低廉，非常适合筛查胰腺癌高危人群的基因突变，因此有高的社会效率与经济效率。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0009]本专利技术第一方面提供了一种用于早期检测胰腺癌的多联合基因靶点，包括KRAS基因的第2号外显子的第12和13密码子的7种突变型，ADAMTS1的甲基化与BNC1的甲基化。
[0010]作为本专利技术的一种优选方案，所述KRAS基因的第2号外显子的第12和13密码子的7种突变型包括Gly12Ser，Gly12Aeg，Gly12Cys，Gly12Asp，Gly12Ala，Gly12Val与Gly13Asp。
[0011]本专利技术第二方面提供了检测KRAS基因突变、ADAMTS1与BNC1甲基化的引物探针，包括针对检测上述的7种KRAS基因突变型的捕获探针组A，检测ADAMTS1甲基化的引物探针组B，检测BNC1甲基化的引物探针组C与检测ATCB基因的引物探针组D；
[0012]所述引物探针组B包括正向引物b，反向引物b和探针b；
[0013]所述引物探针组C包括正向引物c，反向引物c和探针c；
[0014]所述引物探针组D包括正向引物d，反向引物d和探针d；
[0015]所述探针b，探针c和探针d的5
’
端设有报告荧光基团，所述所述探针b，探针c和探针d的3
’
端设有淬灭荧光基团。
[0016]作为本专利技术的一种优选方案，所述正向引物b的核苷酸序列为SEQ ID No.1，SEQ ID No.3或SEQ ID No.5；所述反向引物b的核苷酸序列为SEQ ID No.2，SEQ ID No.4或SEQ ID No.6；所述探针b的核苷酸序列为SEQ ID No.13。
[0017]作为本专利技术的一种优选方案，所述正向引物c的核苷酸序列为SEQ ID No.7，SEQ ID No.9或SEQ ID No.11；所述反向引物c的核苷酸序列为SEQ ID No.8，SEQ ID No.10或SEQ ID No.12；所述探针c的核苷酸序列为SEQ ID No.14。
[0018]作为本专利技术的一种优选方案，所述正向引物d的核苷酸序列为SEQ ID No.19；所述反向引物d的核苷酸序列为SEQ ID No.20；所述探针d的核苷酸序列为SEQ ID No.15。
[0019]作为本专利技术的一种优选方案，报告荧光基团包括FAM，HEX，VIC，TET，CY3，CY5或ROX，淬灭荧光基团为BHQ1。
[0020]作为本专利技术的一种优选方案，捕获探针组A为SEQ ID No.16与SEQ ID No.17。
[0021]本专利技术第三方面提供了一种检测KRAS基因突变、ADAMTS1与BNC1甲基化的试剂盒，包括上述的引物探针。
[0022]本专利技术第四方面提供了KRAS基因突变、ADAMTS1与BNC1甲基化的检测方法，包括使用上述的引物探针或上述的试剂盒；所述检测方法包括以下步骤：
[0023]1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于早期检测胰腺癌的多联合基因靶点，其特征在于，包括KRAS基因的第2号外显子的第12和13密码子的7种突变型，ADAMTS1的甲基化与BNC1的甲基化。2.根据权利要求1所述的一种用于早期检测胰腺癌的多联合基因靶点，其特征在于，所述KRAS基因的第2号外显子的第12和13密码子的7种突变型包括Gly12Ser，Gly12Aeg，Gly12Cys，Gly12Asp，Gly12Ala，Gly12Val与Gly13Asp。3.检测KRAS基因突变、ADAMTS1与BNC1甲基化的引物探针，其特征在于，所述引物探针包括针对检测权利要求1
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2任一项所述的7种KRAS基因突变型的捕获探针组A，检测ADAMTS1甲基化的引物探针组B，检测BNC1甲基化的引物探针组C与检测ATCB基因的引物探针组D；所述引物探针组B包括正向引物b，反向引物b和探针b；所述引物探针组C包括正向引物c，反向引物c和探针c；所述引物探针组D包括正向引物d，反向引物d和探针d；所述探针b，探针c和探针d的5
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端设有报告荧光基团，所述探针b，探针c和探针d的3
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端设有淬灭荧光基团。4.根据权利要求3所述的检测KRAS基因突变、ADAMTS1与BNC1甲基化的引物探针，其特征在于，所述正向引物b的核苷酸序列为SEQ ID No.1，SEQ ID No.3或SEQ ID No.5；所述反向引物b的核苷酸序列为SEQ ID No.2，SEQ ID No.4或SEQ ID No.6；所述探针b的核苷酸序列为SEQ ID No.13。5.根据权利要求3所述的检测KRAS基因突变、ADAMTS1与BNC1甲基化的引物探针，其特征在于，所述正向引物c的核苷酸序列为SEQ ID No.7，SEQ ID No.9或SEQ ID No.11；所述反向引物c的核苷酸序列为SEQ ID No.8，SEQ ID No.10或SEQ ID No.12；所述探针c的核苷酸序列为SEQ ID No.14。6.根据权利要求3所述的检...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨柳，童云广，蒋佳宏，唐正清，张叔祖，朱虹，任永丽，陈哲灵，
申请(专利权)人：杭州奥明医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：