一种肝纤维化动物模型的构建方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种肝纤维化动物模型的构建方法及应用，其是利用基因编辑技术定向引入LEPTIN基因2号外显子的部分序列的缺失突变，敲除LEPTIN基因，再体细胞核移植的方法获得阳性个体，通过生理学和病理学的表型鉴定建立的能反映人类NAFLD尤其是肝纤维化症状的动物模型。本发明专利技术构建的实验动物在生长过程中随着年龄增长出现不同程度的NAFLD肝损伤，42.9％的LEPTIN基因敲除猪在22-35月龄中出现中重度肝纤维化症状。构建的肝纤维化模型为目前的肥胖及肝损伤研究提供了新型的、更接近于人类的疾病模型,为相关疾病的临床药物筛选和有效诊疗方案的研发提供有利工具。方案的研发提供有利工具。

【技术实现步骤摘要】
一种肝纤维化动物模型的构建方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地说，涉及一种肝纤维化动物模型的构建方法及其应用。

技术介绍

[0002]在肥胖导致的并发症及代谢综合征中,肝损伤也是最重要的影响人类健康的疾病之一。肥胖症患者的肝脏脂肪沉积早就被发现,但肥胖相关性肝病及其潜在危害近年来才引起重视,在世界范围内,肥胖正在成为导致非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的最重要原因。该疾病期初为单纯性脂肪肝(脂肪变性),再发展为非酒精性脂肪性肝炎(NASH),进而恶化为肝纤维化直到肝硬化，NAFLD发生于无过量酒精摄入史的人群,单纯性脂肪肝是良性的,而NASH的病变特征是肝细胞损伤、炎症和纤维化,这些病变可导致肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌(HCC)。肥胖对这些肝脏继发性疾病的影响很大,从一组严重肥胖患者(BMI＞35kg/m2)病例的肝脏组织学的检查结果来统计,只有9％的患者肝组织学正常,有1％～2％的患者有先前未被证实的肝硬化。近90％的患者有脂肪变性,其中有1/3的患者符合非酒精性脂肪肝性肝炎(NASH)的标准,并有40％的患者存在不同程本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肝纤维化动物模型的构建方法，其特征在于，在动物LEPTIN基因引入双位点突变。2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用基因编辑技术在猪LEPTIN基因的等位基因上引入双位点突变；所述双位点突变分别位于猪LEPTIN的不同等位基因上，其中一个突变位点位于猪LEPTIN基因2号外显子的3468-3472位点的“TTGTC”碱基的缺失；另一突变位点位于猪LEPTIN基因2号外显子的3473-3474“CA”碱基的缺失；(2)筛选猪LEPTIN基因突变的猪细胞克隆点。3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，还包括步骤：(3)将筛选出阳性克隆点的细胞核用体细胞核移植技术转入去核的卵母细胞中，体外融合为重构配，再移入代孕母猪子宫中，妊娠生产出克隆猪；(4)采用PCR和测序方法鉴定出LEPTIN基因突变的克隆猪。4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述引入双位点突变的方法包括同源重组、ZFN、TALEN、CRISPR-Cas9、RNAi；或，当采用ZFN方法时，利用质粒载体在猪胎儿成纤维细胞中表达出锌指核酸酶，所述质粒载体的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。5.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢怡明，檀覃，李宁，王润铭，张力，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：