一种鉴别贵州地区金荞麦的SSR分子标记引物及其方法技术

本发明专利技术提供一种鉴别贵州地区金荞麦的SSR分子标记引物及其方法，方法包括如下步骤：以待鉴定金荞麦样本的总DNA为模板，用SSR分子标记物进行PCR扩增，得到扩增产物；对扩增产物进行毛细管电泳测序分型，得到扩增产物的分型结果；将扩增产物的分型结果用GeneMarker4.0进行峰图判读，得到等位基因矩阵；根据等位基因矩阵，通过GenALEx计算金荞麦的遗传多样性数据；基于GenALEx计算所得的遗传多样性数据，通过MEGA进行UPGMA聚类分析，构建聚类树。解决现有金荞麦产地鉴别多运用性状鉴别及显微鉴别等方法，依赖个人经验及主观判断，准确性不高，技术可推广性不强的技术问题。技术可推广性不强的技术问题。技术可推广性不强的技术问题。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴别贵州地区金荞麦的SSR分子标记引物及其方法


[0001]本专利技术属于分子生物学分子标记领域，特别涉及一种鉴别贵州地区金荞麦的SSR分子标记引物及方法。

技术介绍

[0002]金荞麦为蓼科植物金荞麦的干燥根茎，金荞麦又叫野荞麦、天荞麦、开金锁、野荞麦根，金荞麦有清热解毒、散风化痰、活血散淤、健脾利湿的功效，金荞麦有治疗咽喉肿痛、肺热咳嗽、肺痈痰臭、风湿痹痛、肺脓疡、痢疾的作用。
[0003]不同产地的金荞麦的药效质量差异较大。药材的“道地性”是由于各个地区生态环境差异导致药材的药效不同，特定的地理气候种植的特定的药材，才能更好地发挥药效，也是道地药材的精髓。
[0004]金荞麦产地的鉴别一直是金荞麦物种鉴定的技术难点，也是当前中药资源产业面临的行业难题。当前金荞麦产地鉴别多运用性状鉴别及显微鉴别等方法，依赖个人经验及主观判断，准确性不高，技术可推广性不强。

技术实现思路

[0005]为了克服现有技术的缺陷，本专利技术提供一种鉴别贵州地区金荞麦的SSR分子标记引物及其方法，解决当前金荞麦产地鉴别多运用性状鉴别及显微鉴别等方法，依赖个人经验及主观判断，准确性不高，技术可推广性不强的技术问题。
[0006]本专利技术通过如下技术方案实现：
[0007]一种鉴别贵州地区金荞麦的SSR分子标记引物，包括以下引物对：
[0008][0009]进一步的，所述引物对的退火温度为59℃-63℃之间，所述引物对的长度在21bp-25bp之间，PCR产物长度在100bp-200bp之间。
[0010]进一步的，利用所述的SSR分子标记引物鉴别贵州地区金荞麦的方法，包括如下步骤：
[0011]以待鉴定金荞麦样本的总DNA为模板，用所述SSR分子标记引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
[0012]对所述PCR扩增产物进行毛细管电泳测序分型，得到PCR扩增产物的分型结果；
[0013]将所述PCR扩增产物的分型结果用GeneMarker4.0进行峰图判读，记录等位基因片段大小，得到等位基因矩阵；
[0014]根据所述等位基因矩阵，通过GenALEx计算金荞麦在每个居群间、每个个体间的遗传多样性数据；
[0015]基于GenALEx计算所得的遗传多样性数据，通过MEGA进行UPGMA聚类分析，构建聚类树。
[0016]进一步的，利用mCTAB法提取待鉴定金荞麦样本的总DNA。
[0017]进一步的，将待鉴定金荞麦样本的总DNA为模板之前，还包括将待鉴定金荞麦样本的总DNA进行纯化。
[0018]进一步的，所述PCR扩增的反应程序为：94℃预变性4min；94℃变性0.5min，退火0.5min，72℃延伸1min，重复32个循环；72℃延伸10min。
[0019]进一步的，所述PCR扩增的反应体系为：ddH2O 11.8μL，10
×
Taq Buffer 2μL，2mM dNTP 2μL，5uM Forward primer 1μL，5uM Reverse primer 1μL，Taq DNA polymerase 0.2μL，50ng/μL的DNA模板2μL。
[0020]进一步的，对所述PCR扩增产物进行毛细管电泳测序分型之前，还包括，将所述PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
[0021]进一步的，所述记录等位基因片段大小，得到等位基因矩阵具体包括：以二元方式来记录等位基因片段大小，即某一等位基因存在时记为1，某一等位基因不存在时记0，缺失数据记为-9，从而得到等位基因矩阵。
[0022]进一步的，所述遗传多样性数据包括遗传相似性系数、等位基因数NA、期望杂合度HE、观测杂合度HO、Shannon's指数。
[0023]和最接近的现有技术比，本专利技术的技术方案具备如下有益效果：
[0024]本专利技术应用基因组技术及SSR分子标记技术，利用金荞麦基因组设计SSR引物，并通过云南、贵州以及四川等地的金荞麦样本筛选出4对SSR分子标记引物，用于特异性鉴别贵州地区金荞麦样本，准确度高、稳定性强、易于大范围推广应用。
附图说明
[0025]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0026]图1为基于本专利技术的SSR分子标记引物构建的不同主产区金荞麦样本的UPGMA聚类图。
[0027]图2为对未知的金荞麦样本基于本专利技术的SSR分子标记引物在UPGMA聚类图的鉴定结果示意图。
具体实施方式
[0028]下面将结合本专利技术的实施例，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，
所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0029]本实施例提供SSR分子标记引物鉴别贵州地区金荞麦的方法，具体包括如下步骤：
[0030]S1：利用mCTAB法提取待鉴定金荞麦样本叶片的总DNA，具体包括如下步骤：
[0031](1)取金荞麦样本叶片100mg放入2.0mL的离心管中，同时加入少量石英砂和一颗磁珠，金荞麦样本叶片浸入液氮中冻存1min左右，置于研磨机中打磨至细小的粉末状材料备用；
[0032](2)在研磨好的粉末状材料中加入1.5mL buffer A(0.1M Tris-HCl pH8.0；5mM EDTA；0.25M NaCl；1％PVP-40)溶液，反复颠倒离心管使溶液与材料粉末均质混匀，冰浴10min，期间将沉淀下的粉末重新均质混合两次，10000
×
g离心后，弃掉上清液，得到第一次沉淀。
[0033](3)将第一次沉淀再次加入1.5mL buffer A(0.1M Tris-HCl pH8.0；5mM EDTA；0.25M NaCl；1％PVP-40)溶液，反复颠倒离心管使溶液与材料粉末均质混匀，冰浴10min，期间将沉淀下的粉末重新均质混合两次，10000
×
g离心后，弃掉上清液，得到第二次沉淀。
[0034](4)在第二次沉淀中加入800μL预热的2％CTAB(0.1M Tris-HCl pH8.0；1.4M NaCl；25mM EDTA；2％(w/v)CTAB；0.2％(v/v)β-巯基乙醇；1％PVP-40)溶液，将沉淀均质悬浮于溶液后置于65℃水浴锅中保存1.5-2h,期间颠倒均质溶液3-5次,得到第一次混合液。
[0035](5)将第一次混合液进行10000
×
g室温离心，获取第一次DNA上清液，将第一次DNA上清液小心倒入一个新的2.0mL离心管中，加入等体积本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴别贵州地区金荞麦的SSR分子标记引物，其特征在于，包括以下引物对：2.根据权利要求1所述的鉴别贵州地区金荞麦的SSR分子标记引物，其特征在于，所述引物对的退火温度为59℃-63℃之间，所述引物对的长度在21bp-25bp之间，PCR产物长度在100bp-200bp之间。3.利用权利要求1-2任一项所述的SSR分子标记引物鉴别贵州地区金荞麦的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：以待鉴定金荞麦样本的总DNA为模板，用所述SSR分子标记引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；对所述PCR扩增产物进行毛细管电泳测序分型，得到PCR扩增产物的分型结果；将所述PCR扩增产物的分型结果用GeneMarker4.0进行峰图判读，记录等位基因片段大小，得到等位基因矩阵；根据所述等位基因矩阵，通过GenALEx计算金荞麦在每个居群间、每个个体间的遗传多样性数据；基于GenALEx计算所得的遗传多样性数据，通过MEGA进行UPGMA聚类分析，构建聚类树。4.根据权利要求3所述的SSR分子标记引物鉴别贵州地区金荞麦的方法，其特征在于，利用mCTAB法提取待鉴定金荞麦样本的总DNA。5.根据权利要求1或3所述的SSR分子标记引物鉴别贵州地区金荞麦的方法，其特征在于，将待鉴定金荞麦样本的总DNA为模板之前，还包括将待鉴定金荞麦样本的总DNA进行纯化。6.根据权利要求3所述的SSR分子标记引物鉴别贵州地区金荞麦的方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：王继永，郑司浩，李进瞳，曾燕，赵莎，刘美娟，尚兴朴，王浩，刘国城，静一，孙文静，朱亚兵，
申请(专利权)人：深圳华大基因科技服务有限公司国药种业有限公司，
类型：发明
国别省市：