MPT64蛋白的检测试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及一种MPT64蛋白的检测试剂盒及检测方法，检测试剂盒包括第一抗体、第二抗体、模板DNA、脂质体原料和扩增引物对；其中，所述第一抗体和所述第二抗体能够与MPT64蛋白特异性结合，所述扩增引物对能够特异性扩增所述模板DNA。本发明专利技术的检测方法用第一抗体直接包被PCR反应管，用其代替免疫脂质体PCR方法中的酶标板形式，并以改进的免疫脂质体技术为基础建立MPT64蛋白快速超敏检测方法，提高了免疫脂质体PCR的简易性，而且能够进一步提高蛋白质检测的灵敏度。检测的灵敏度。检测的灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
MPT64蛋白的检测试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术涉及生物检测
，特别是涉及一种MPT64蛋白的检测试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]尽管结核病在全球范围内得到了有效控制，但我们离消灭结核病的目标还有很长一段距离。近年来，全球人口流动的加剧、艾滋病合并结核病感染病例的上升、耐多药及泛耐药结核病的增多给结核病防治带来了巨大挑战。与此同时，结核病诊断治疗领域特别是早期诊断方面进展甚微，现有的各种结核病快速诊断技术均不能同时满足简便、准确和廉价的要求。面对严峻的结核病防治形势，发展和应用新的快速诊断方法已成为结核病临床研究的核心内容。当前结核杆菌(TB)的实验室诊断主要依赖于传统的涂片、培养法，但这些方法操作繁琐、检测周期长，已远不能满足临床TB快速诊断的需求。近年来发展起来的一些快速诊断方法，如实时荧光PCR、细胞免疫检测方法等，虽然解决了诊断时效的问题，但是在诊断准确性方面却不如人意。
[0003]MPT64蛋白是结核分枝杆菌在培养早、中期分泌释放于菌体外并游离于培养基中的一组蛋白，由RD2区基因Rv1980c编码，相对分子质量为24000，约占结核分枝杆菌培养基上清滤过液中蛋白总量的8％。因此，MPT64蛋白可以作为结核分枝杆菌快速诊断的靶蛋白。
[0004]免疫脂质体PCR技术是近几年才建立并逐步发展的一种新的蛋白质超敏检测方法，其在医学领域特别是疾病诊断方面应用前景十分可喜。其检测靶蛋白的基本原理是：首先用抗靶蛋白抗体包被酶标板孔，接着加入待测标本，孵育一定时间后加入生物素化的抗靶蛋白抗体，然后分别加入亲和素和生物素化脂质体，反应一段时间后洗板去除游离的生物素化脂质体，用破膜剂破坏脂质体而使其包裹的DNA片段释放入溶液中，吸取少量溶液进行Taqman实时荧光PCR，扩增Ct值的大小即可反映出待测标本中靶蛋白的浓度。美中不足的是，现有的免疫脂质体PCR技术不能实现单管检测，而且整个操作过程比较复杂繁琐。

技术实现思路

[0005]基于此，有必要提供一种可以实现单管检测、操作快捷简便的MPT64蛋白的检测试剂盒。
[0006]一种MPT64蛋白的检测试剂盒，包括第一抗体、第二抗体、模板DNA、脂质体原料和扩增引物对；其中，所述第一抗体和所述第二抗体能够与MPT64蛋白特异性结合，所述扩增引物对能够特异性扩增所述模板DNA。
[0007]在其中一个实施例中，所述模板DNA的序列如SEQ ID NO：1所示。
[0008]在其中一个实施例中，所述扩增引物对的序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。
[0009]在其中一个实施例中，还包括PCR缓冲液、荧光探针和DNA聚合酶。
[0010]在其中一个实施例中，所述脂质体原料包括胆固醇、卵磷脂和磷脂酰乙醇胺。
[0011]在其中一个实施例中，还包括乙醚、氯仿、戊二醛和BSA。
[0012]在其中一个实施例中，所述第一抗体为鼠源抗体，所述第二抗体为兔源抗体。
[0013]本专利技术还提供了一种非疾病的诊断和治疗目的的MPT64蛋白的检测方法，包括以下步骤：
[0014]用能够与MPT64蛋白特异性结合的第一抗体包被PCR反应管，得到包被反应管；
[0015]用能够与MPT64蛋白特异性结合的第二抗体标记包裹有模板DNA的脂质体，得到免疫脂质体；
[0016]在所述包被反应管中加入待测样本孵育，然后加入所述免疫脂质体孵育；
[0017]使用清洗缓冲液洗涤所述包被反应管，然后加入PCR反应液对所述模板DNA进行扩增；
[0018]检测扩增产物的含量，根据所述扩增产物的含量计算所述待测样本中MPT64蛋白的含量。
[0019]在其中一个实施例中，所述脂质体由胆固醇、卵磷脂和磷脂酰乙醇胺制备得到。
[0020]在其中一个实施例中，所述胆固醇、卵磷脂和磷脂酰乙醇胺的摩尔比为(9～11):(5～7):(1～3)。
[0021]本专利技术MPT64蛋白的检测试剂盒的原理如下：
[0022]使用第一抗体包被PCR反应管，使用第二抗体标记包裹模板DNA的脂质体制备免疫脂质体。在包被的PCR反应管中加入待测样本，孵育一段时间后加入免疫脂质体，则待测样本中的MPT64蛋白会先后与第一抗体和第二抗体形成第一抗体-MPT64蛋白-第二抗体免疫脂质体复合物。接着移除PCR反应管中的液体并加入缓冲液洗涤，加入PCR反应液对脂质体释放出的模板DNA进行扩增。在固定时间内扩增产物量与模板DNA量成正比，而模板DNA的量则与待测样本中的MPT64蛋白含量成正比，这样通过检测扩增产物的含量就可以计算出待测样本中MPT64蛋白的含量。
[0023]与现有的检测试剂盒和检测方法相比，本专利技术的有益效果如下：
[0024](1)操作简便：试验过程无需在酶标板上进行多次洗板，直接在PCR反应管中加入缓冲液洗涤即可，可实现单管检测。
[0025](2)高特异性：采用双抗体夹心方式来特异检测MPT64蛋白，反应较少受到血清中高丰度蛋白的影响。
[0026](3)高灵敏性：能检测出的最低值可达fg/mL，可低至ELISA方法的1/2000。
附图说明
[0027]图1为实施例2制备的免疫脂质体的透射电镜图。
具体实施方式
[0028]为了便于理解本专利技术，下面将对本专利技术进行更全面的描述，并给出了本专利技术的较佳实施例。但是，本专利技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本专利技术的公开内容的理解更加透彻全面。
[0029]除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本专利技术的
的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本专利技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具
体的实施例的目的，不是旨在于限制本专利技术。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0030]本专利技术一实施例的MPT64蛋白的检测试剂盒，包括第一抗体、第二抗体、模板DNA、脂质体原料和扩增引物对。其中，第一抗体和第二抗体能够与MPT64蛋白特异性结合，扩增引物对能够特异性扩增模板DNA。
[0031]本专利技术MPT64蛋白的检测试剂盒的原理如下：
[0032]使用第一抗体包被PCR反应管，使用第二抗体标记包裹模板DNA的脂质体制备免疫脂质体。在包被的PCR反应管中加入待测样本，孵育一段时间后加入免疫脂质体，则待测样本中的MPT64蛋白会先后与第一抗体和第二抗体形成第一抗体-MPT64蛋白-第二抗体免疫脂质体复合物。接着移除PCR反应管中的液体并加入缓冲液洗涤，加入PCR反应液对脂质体释放出的模板DNA进行扩增。在固定时间内扩增产物量与模板DNA量成正比，而模板DNA的量则与待测样本中的MPT64蛋白含量成正比，这样通过检测扩增产物的含量就可以计算出待测样本中MPT64蛋白的含量。
[0033]与现有的检测试剂盒和检本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种MPT64蛋白的检测试剂盒，其特征在于，包括第一抗体、第二抗体、模板DNA、脂质体原料和扩增引物对；其中，所述第一抗体和所述第二抗体能够与MPT64蛋白特异性结合，所述扩增引物对能够特异性扩增所述模板DNA。2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述模板DNA的序列如SEQ ID NO：1所示。3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述扩增引物对的序列分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。4.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括PCR缓冲液、荧光探针和DNA聚合酶。5.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述脂质体原料包括胆固醇、卵磷脂和磷脂酰乙醇胺。6.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括乙醚、氯仿、戊二醛和BSA。7.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹小毛，
申请(专利权)人：南方医科大学第五附属医院，
类型：发明
国别省市：