一种批量构建和筛选重组质粒的方法技术

本申请公开了一种批量构建和筛选重组质粒的方法。本申请批量构建和筛选重组质粒的方法包括，将含有若干个目的片段的DNA溶液与质粒载体连接，进行转化；对转化后的宿主菌进行培养，挑取不少于目的片段数量的单克隆菌落；对单克隆菌落进行PCR扩增和测序；将测序结果导入Excel表格中，利用Excel表格中的函数对测序结果进行批量比对，批量获得重组质粒及其插入目的片段的信息。本申请方法，只需进行一次质粒连接和转化试验，即可一次性完成多个重组质粒的构建；挑取单克隆菌落PCR扩增和测序后，利用Excel表格中的函数对测序结果进行批量比对，即可批量获得重组质粒及其插入的目的片段的信息，实现批量构建和筛选重组质粒。实现批量构建和筛选重组质粒。实现批量构建和筛选重组质粒。

【技术实现步骤摘要】
一种批量构建和筛选重组质粒的方法


[0001]本申请涉及重组质粒构建
，特别是涉及一种批量构建和筛选重组质粒的方法。

技术介绍

[0002]质粒是基因工程中重要的运载体，可以通过质粒把一些想要的基因导入其它生物的体内。通过质粒携带一些基因片段，可以是编码基因，也可以是调控区等，在细胞内环境中进行表达或参与通路的相互作用，达成预期目的。例如取得蛋白产物，这些产物有直接提取的，也有表达酶进行药物合成的；又例如探究基因相互作用关系，比如过表达某一特定基因观察表型变化。重组质粒即携带外源基因片段的质粒。
[0003]目前，构建和筛选重组质粒的方法是，先获其目的片段，对质粒进行双酶切；将目的片段与质粒连接，转化到大肠杆菌或其它宿主菌中，并进行菌培养；然后，通过菌落PCR和测序，确定重组质粒；进行重组质粒提取。以上方法是一个目的片段做一个连接反应，相应的做一个转化；如果需要构建的质粒数目少，这种方法是最适合的，但是当短期内需要构建的质粒数目巨大，用这种常用的方法无疑会耗费较多的时间、成本以及人力，并不是最优方案。
[0004]正因为质粒的作用非常重要，当需要用到的质粒数目较多时，若针对每个质粒去单独构建，需要花费的时间，人力以及成本耗费较大，因此，能够大批量构建质粒的方法是很有必要的。有研究显示，可以将多个目的片段混合在一起进行连接、转化，然后挑取各单克隆菌落进行培养，最后通过测序和序列比对，确定各单克隆菌落，获得批量的重组质粒。但是，这种方法最后的测序结果比对采用的是DNAStar或BLAST，需要将各测序结果逐一对比，才能确定和筛选出各目的片段对应的重组质粒。该方法虽然多个目的片段是混合在一起进行连接和转化，节约了实验程序；但是，最终的测序结果比对仍然需要花费大量的时间。
[0005]因此，如何快速、高效的实现重组质粒的批量构建和筛选，仍然是本领域亟待解决的技术问题。

技术实现思路

[0006]本申请的目的是提供一种新的批量构建和筛选重组质粒的方法。
[0007]本申请具体采用了以下技术方案：
[0008]本申请的一方面公开了一种批量构建和筛选重组质粒的方法，包括以下步骤：
[0009]将含有若干个目的片段的DNA溶液与质粒载体连接，然后进行转化；
[0010]对转化后的宿主菌进行培养，然后挑取不少于目的片段数量的单克隆菌落；
[0011]对单克隆菌落进行PCR扩增和测序；
[0012]将测序结果导入Excel表格中，利用Excel表格中的函数对测序结果进行批量比对，批量获得重组质粒及其插入目的片段的信息。
[0013]需要说明的是，本申请批量构建和筛选重组质粒的方法，创造性的利用Excel表格中的函数对测序结果进行批量比对，可以高效快速的比对出每一个单克隆菌落样品的重组质粒插入目的片段对应的基因名称，实现重组质粒的大批量构建和筛选，能很大程度的节省成本、时间和人工。
[0014]本申请的一种实现方式中，利用Excel表格中的函数对测序结果进行批量比对，包括以下步骤：
[0015]a.建立目的片段的Excel表数据库，其中包含各目的片段的基因名称，目的片段的序列，以及截取自目的片段序列前N个碱基的序列；
[0016]b.新建立一个Excel表，将测序文件的名称复制到所述Excel表中；
[0017]c.将测序结果批量导入步骤b的Excel表中；
[0018]d.使用Excel表中的FIND函数找到测序结果中插入的目的片段序列在测序结果序列中的具体位置；
[0019]e.使用Excel表中的MID函数截取测序结果中插入的目的片段的前N个碱基序列；
[0020]f.使用Excel表中的VLOOKUP函数批量比对步骤e截取自测序结果中插入的目的片段的前N个碱基序列，与步骤a截取自目的片段序列前N个碱基的序列，获得各测序样品的目的片段对应的基因名称，实现重组质粒批量筛选。
[0021]需要说明的是，本申请的步骤a中，截取目的片段序列前N个碱基的序列，主要是为了方便后续的比对；一方面，目的片段的序列比较大，截取其中前N个碱基序列进行比对可以缩小比对量，提高比对效率；另一方面，目的片段的序列大小是不一致的，截取其中前N个碱基序列，可以统一比对片段的大小，便于后续VLOOKUP函数的比对。
[0022]至于N的具体取值，以能够体现各目的片段特异性的最短序列为准；可以理解，序列越短，比对速度越快，但是相应的特异性会受影响；因此，既要保障比对速度，又要考虑比对的特异性，本申请的一种实现方式中，具体截取目的片段前100个碱基序列用于后续比对。
[0023]此外，原则上，只要截取目的片段的序列进行比对即可，不一定是目的片段序列前N个碱基的序列，也可以是中间N个碱基的序列；截取目的片段序列前N个碱基的序列，只是本申请的一种实现方式中为了便于操作，将其设计为前N个碱基的序列。
[0024]本申请的一种实现方式中，步骤a中，将各目的片段的序列放置在A列，N等于100bp，将目的片段序列的前100bp放置在B列，C列为各目的片段的基因名称。
[0025]本申请的一种实现方式中，步骤b中，将测序文件的名称复制到Excel表中，包括在测序文件所在的文件夹中，新建文本，打开该文本文件，输入dir>tp.txt，保存并关闭该文件，然后修改该文本文件拓展名为bat，双击运行该bat文件，打开新生成的名为tp的文本文件，复制里面的内容并粘贴到Excel表中，执行数据
‑
分列命令，各测序文件的名称会出现在单独的一列中，复制该测序文件的名称到Excel表中的A列。
[0026]本申请的一种实现方式中，步骤c中，用DNAStar Editseq工具将测序结果批量导入步骤b的Excel表中的B列。
[0027]本申请的一种实现方式中，步骤d中，在步骤b的Excel表的C列使用FIND函数找到目的片段序列。
[0028]本申请的一种实现方式中，步骤e中，在步骤b的Excel表的D列使用MID函数截取测
序结果中插入的目的片段的前100个碱基序列。
[0029]本申请的一种实现方式中，在挑取单克隆菌落时，至少挑取目的片段数量3倍的单克隆菌落用于重组质粒筛选。
[0030]需要说明的是，至少挑取目的片段数量3倍的单克隆菌落，主要是为了确保挑取的单克隆菌落的重组质粒能够涵盖所有的目的片段；可以理解，如果提取的单克隆菌落数量太少，则容易遗漏部分目的片段的重组质粒；如果挑取的单克隆菌落数量太多，则会增加测序和人工成本。因此，本申请的一种实现方式中具体挑取目的片段数量3倍的单克隆菌落用于重组质粒筛选。
[0031]本申请的另一方面公开了一种用于自免抗体类疾病相关基因的重组质粒批量构建的试剂盒，包括用于自免抗体类疾病相关基因扩增的特异性引物，这些自免抗体类疾病相关基因包括AARS1、AQP4、ARHGAP26、CNTN1、CNTN2、DNE本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种批量构建和筛选重组质粒的方法，其特征在于：包括以下步骤，将含有若干个目的片段的DNA溶液与质粒载体连接，然后进行转化；对转化后的宿主菌进行培养，然后挑取不少于目的片段数量的单克隆菌落；对单克隆菌落进行PCR扩增和测序；将测序结果导入Excel表格中，利用Excel表格中的函数对测序结果进行批量比对，批量获得重组质粒及其插入目的片段的信息。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述利用Excel表格中的函数对测序结果进行批量比对，包括以下步骤，a.建立目的片段的Excel表数据库，其中包含各目的片段的基因名称，目的片段的序列，以及截取自目的片段序列前N个碱基的序列；b.新建立一个Excel表，将测序文件的名称复制到所述Excel表中；c.将测序结果批量导入步骤b的Excel表中；d.使用Excel表中的FIND函数找到测序结果中插入的目的片段序列在测序结果序列中的具体位置；e.使用Excel表中的MID函数截取测序结果中插入的目的片段的前N个碱基序列；f.使用Excel表中的VLOOKUP函数批量比对步骤e截取自测序结果中插入的目的片段的前N个碱基序列，与步骤a截取自目的片段序列前N个碱基的序列，获得各测序样品的目的片段对应的基因名称，实现重组质粒批量筛选。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤a中，将各目的片段的序列放置在A列，N等于100bp，将目的片段序列的前100bp放置在B列，C列为各目的片段的基因名称。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤b中，所述将测序文件的名称复制到所述Excel表中，包括在测序文件所在的文件夹中，新建文本，打开该文本文件，输入dir>tp.txt，保存并关闭该文件，然后修改该文本文件拓展名为bat，双击运行该bat文件，打开新生成的名为tp的文本文件，复制里面的内容并粘贴到Excel表中，执行数据
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分列命令，各测序文件的名称会出现在单独的一列中，复制该测序文件的名称到所述Excel表中的A列。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤c中，用DNAStar Editseq工具将测序结果批量导入步骤b的Excel表中的B列。6.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈爽，黄铭伟，刘阳，李阳，
申请(专利权)人：安吉康尔深圳科技有限公司，
类型：发明
国别省市：