一种快速、高通量检测幽门螺旋杆菌耐药性的方法技术

本发明专利技术公开了快速、高通量检测幽门螺旋杆菌耐药性的方法。分离获取幽门螺旋杆菌样品，对幽门螺旋杆菌进行如下检测：检测克拉霉素耐药基因23S rRNA的突变位点：109G

【技术实现步骤摘要】
一种快速、高通量检测幽门螺旋杆菌耐药性的方法

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[0001]本专利技术属于微生物
以及医药
，具体涉及一种快速、高通量检测幽门螺旋杆菌耐药性的方法。

技术介绍
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[0002]幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，HP)是一种革兰氏阴性、微需氧螺旋状细菌，与人类胃肠道疾病有关。HP感染可引起慢性胃炎，并导致多种并发症，如消化不良、消化性溃疡和胃癌。据统计，全球约90％的胃癌发病与HP感染密切相关。因此，HP感染严重威胁人类的健康、造成庞大的经济与社会损失，预防和治疗幽门螺旋杆菌感染具有巨大的应用研究价值。
[0003]抗生素治疗是目前清除HP的主要方案，但由于胃内存在大量胃酸及消化酶，可灭活绝大部分抗生素，因此现有的多数抗生素不能用于HP的治疗。迄今为止，仅5种抗生素在全球范围内获批用于HP的治疗：阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星、甲硝唑及四环素。然而，大量研究数据指出，我国流行的HP对上述五种抗生素的耐药率在逐年爬升。至2017年，我国HP流行株对不同抗生素的耐药情况为：克拉霉素28.9％、甲硝唑63.8％、左氧氟沙星28.0％、阿莫西林3.1％、四环素3.9％。
[0004]HP耐药性检测的金标准为美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)提出的琼脂稀释法。该方法对实验人员专业水平、实验设备、实验耗材均有较高要求，难以在临床应用中开展。因此，寻求简便、准确率高的HP耐药性评判新标准有重要的应用意义。
[0005]目前认为HP耐受抗生素主要由该菌基因组中特定基因发生随机突变导致。HP基因发生突变后，抗生素难以结合到其作用靶点或药物难以在菌体内由前体药物转化为作用药物，均导致HP对抗生素耐药。因此，研究者通过大数据分析手段统计分析HP基因突变与耐药表型的规律，继而建立了基于HP特定基因突变预测其耐药表型的模型，为临床医生提供了一套简便、快速的HP药敏预测方案。
[0006]近年来，随着新一代测序技术的发展，微生物学家们逐渐发现HP是一个在种内具有高度变异性的物种，不同大洲人群感染的HP在基因组水平上差异极大。

技术实现思路
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[0007]本专利技术的第一个目的是提供一种准确地预测HP中国流行株对抗生素的耐药情况的快速、高通量检测幽门螺旋杆菌耐药性的方法。
[0008]本专利技术人团队在前期研究中发现，既往文献报道的其他国家发生的HP耐药基因突变并不具有预测中国流行HP株药敏表型的意义(图2)。
[0009]因此，本研究结合我国HP流行株的基因组特征，建立起HP中国流行株耐药基因的分子表征库，并设计出HP中国流行株的耐药基因组分子表征关联模型，针对我国流行HP药敏情况，对于三种易发生耐受的抗生素，设计出适用于我国HP分离株耐药性的快速检测方
案。本方案对比现有方法，有利于协助临床医生对我国HP感染的治疗做出更为精准的判断。
[0010]本专利技术的快速、高通量检测幽门螺旋杆菌耐药性的方法，包括以下步骤：
[0011]分离获取幽门螺旋杆菌样品，对幽门螺旋杆菌进行如下检测：
[0012]检测克拉霉素耐药基因23S rRNA的突变位点：109G
→
A、2056A
→
G、2095T
→
C、2834C
→
T和蛋白infB的突变位点794Glu
→
Asp，如发生任一突变则幽门螺旋杆菌具有克拉霉素耐药性；
[0013]或检测左氧氟沙星耐药基因的蛋白gyrA的突变位点：87Asn
→
Lys、91Asp
→
Asn/Gly/Tyr和蛋白gyrB的突变位点：684Glu
→
Asp，如发生任一突变则幽门螺旋杆菌具有左氧氟沙星耐药性；
[0014]或检测甲硝唑耐药基因的蛋白rdxA的突变位点：16Arg
→
Cys/His和蛋白rpsU的突变位点：56Val
→
Ile和蛋白sodB的突变位点：54Asp
→
Ala，如发生任一突变则幽门螺旋杆菌具有甲硝唑耐药性。
[0015]本专利技术的第二个目的是提供一种快速、高通量检测幽门螺旋杆菌耐药性的试剂盒，其包括：
[0016]检测克拉霉素耐药基因23S rRNA的突变位点：109G
→
A、2056A
→
G、2095T
→
C、2834C
→
T和蛋白infB的突变位点794Glu
→
Asp的试剂；
[0017]或检测左氧氟沙星耐药基因的蛋白gyrA的突变位点：87Asn
→
Lys、91Asp
→
Asn/Gly/Tyr和蛋白gyrB的突变位点：684Glu
→
Asp的试剂；
[0018]或检测甲硝唑耐药基因的蛋白rdxA的突变位点：16Arg
→
Cys/His和蛋白rpsU的突变位点：56Val
→
Ile和蛋白sodB的突变位点：54Asp
→
Ala的试剂。
[0019]本专利技术与现有技术相比，其有益效果为：
[0020]本专利技术经研究发现现有的检测方案不能准确地预测HP中国流行株对抗生素的耐药情况，因此专利技术人建立了首个基于HP中国流行株耐药基因的分子表征库信息的基因
‑
表征关联模型，提出基于该模型的新型快速、高通量HP耐药检测方案。与现有技术相比，本专利技术能更精准地协助临床医生快速预测我国HP的耐药表型。
附图说明
[0021]图1是HP中国流行株耐药基因的分子表征库；HP中国流行株耐药基因的分子表征库部分内容：54株中国分离HP株对克拉霉素、左氧氟沙星、甲硝唑的药敏表型及耐药基因分子特征。54株中国分离HP株的进化关系如左侧进化树所示。长形方框代表菌株对相应抗生素的药敏表型，代表敏感、代表耐药；正方形代表菌株在特定基因位点的情况，代表与ATCC26695一致，无突变发生，代表存在突变。深灰色背景的突变位点为国外文献报道与耐药基因或蛋白突变位点，白色背景的突变位点为本专利技术公布的与中国流行株耐药相关的基因或蛋白突变位点。
[0022]图2是不同耐药基因、蛋白突变对HP中国流行株的三种抗生素MIC的影响；图A、B、C分别显示不同耐药基因或蛋白突变对HP中国流行株MIC的影响。白色为无突变HP分离株的MIC值，黑色为耐药基因突变HP分离株的MIC值。可见发生基因突变的HP株MIC值高于无突变株。图中*所标注的突变位点为本专利新发现的与HP中国流行株耐药相关的基因或蛋白突
变位点。
具体实施方式
[0023]以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。
[0024]下述实施例中涉及的培养基及试剂如下：
[0025]培养基添加抗生素混本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速、高通量检测幽门螺旋杆菌耐药性的方法，其特征在于，包括以下步骤：分离获取幽门螺旋杆菌样品，对幽门螺旋杆菌进行如下检测：检测克拉霉素耐药基因23S rRNA的突变位点：109G
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A、2056A
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G、2095T
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C、2834C
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T和蛋白infB的突变位点794Glu
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Asp，如发生任一突变则幽门螺旋杆菌具有克拉霉素耐药性；或检测左氧氟沙星耐药基因的蛋白gyrA的突变位点：87Asn
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Lys、91Asp
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Asn/Gly/Tyr和蛋白gyrB的突变位点：684Glu
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Asp，如发生任一突变则幽门螺旋杆菌具有左氧氟沙星耐药性；或检测甲硝唑耐药基因的蛋白rdxA的突变位点：16Arg
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Cys/His和蛋白rpsU的突变位点：56Val
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Ile和蛋白sodB的突变位点：54As...

【专利技术属性】
技术研发人员：‑，
申请(专利权)人：广东环凯生物科技有限公司广东科环生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：