一种肝脏类器官培养芯片及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种肝脏类器官培养芯片及其制备方法与应用，所述肝脏类器官培养芯片包括：细胞培养板；具有微孔阵列的生物材料，设于所述细胞培养板内；其中，所述生物材料包括琼脂糖、聚乙二醇和海藻酸钠中的至少一种；所述生物材料上设有多个微孔，且多个所述微孔均匀排列形成所述微孔阵列。所述培养方法包括：将人胚胎干细胞或人诱导多功能干细胞消化成单个细胞接种于培养基中培养，获得前肠胚细胞；将所述前肠胚细胞消化成单个细胞接种于所述肝脏类器官培养芯片中的所述微孔阵列中培养，获得肝脏类器官。本发明专利技术适用于不同来源或者是不同组织类型的均一且高通量的肝脏类器官培养。养。养。

【技术实现步骤摘要】
一种肝脏类器官培养芯片及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及组织工程和器官芯片
，特别涉及一种肝脏类器官培养芯片及其制 备方法与应用。

技术介绍

[0002]类器官是器官特异性细胞的集合，这些细胞从干细胞或器官祖细胞发育而来，并能以 与人体内相似的方式经细胞分序和空间限制性的系别分化而实现自我组建。简而言之，类 器官是一种基于三维(Three
‑
dimensional，3D)体外细胞培养系统，可复制出已分化组织的 复杂空间形态，并能够表现出细胞与细胞之间，细胞与其周围基质之间的相互作用和空间 位置形态。类器官能做到与人体内分化的组织具有相似的生理反应，与人体来源组织具有 极高的相似性。与传统二维(Two
‑
dimensional，2D)细胞培养模式相比，类器官具有实质 性的改进。类器官包含多种细胞类型，突破了细胞间单纯的物理接触联系，形成了更加紧 密的细胞间、细胞与基质间高度相互作用，形成具有功能的“微器官”，能更好地用于模拟器 官组织的发生过程及生理病理状态，在基础研究以及临床诊疗方面具有广阔的应用前景和 商业价值。
[0003]目前，类器官的培养以基质胶培养为主。例如，肝脏类器官传统的培养方法是依赖于 Matrigel的胶滴培养法。利用基质胶培养方法得到的肝脏类器官在形状、大小、以及细胞组 成等方面表现出极大的异质性，严重影响了肝脏类器官培养的质量可控性。此外，在基质 胶中培养的过程中，肝脏类器官之间相对位置容易发生变化，难以定位观察。上述局限性 导致了肝脏类器官的培养过程复杂、差异性大、通量低且不易于实时监测等局限性。
[0004]因此，为了克服上述传统肝脏类器官培养过程复杂、差异性大、通量低且不易于实时 监测等技术问题，有必要开发一种高通量原位培养肝脏类器官培养芯片，以用于肝脏类器 官的应用研究中。

技术实现思路

[0005]本专利技术目的是提供一种肝脏类器官培养芯片及其制备方法与应用，适用于不同来源或 者是不同组织类型的均一且高通量的肝脏类器官培养。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]在本专利技术的第一方面，提供了一种肝脏类器官培养芯片，包括：
[0008]细胞培养板；
[0009]具有微孔阵列的生物材料，设于所述细胞培养板内；其中，所述生物材料包括琼脂糖、 聚乙二醇和海藻酸钠中的至少一种；所述生物材料上设有多个微孔，且多个所述微孔均匀 排列形成所述微孔阵列。
[0010]进一步地，每个所述微孔的深度为0.1mm～5mm。
[0011]进一步地，相邻两个所述微孔之间距离为10μm～1mm。
[0012]进一步地，每个所述微孔的面积为78.00μm2～78.5mm2。
[0013]进一步地，所述生物材料具有生物相容性好、良好的光学通透性、易成型且疏水性或 经疏水性处理的特点，例如0.5％～10％的琼脂糖。
[0014]进一步地，所述细胞培养板包括96孔板、48孔板、24孔板、12孔板、6孔板、3.5cm 培养皿、6cm培养皿和10cm培养皿中的一种。
[0015]在本专利技术的第二方面，提供了所述肝脏类器官培养芯片的制备方法，所述方法包括：
[0016]在PMMA上进行制作，获得具有微孔阵列的PMMA阴模；
[0017]将PDMS倒入所述PMMA阴模上，真空干燥并抽真空，烘干后剥离，获得具有微孔阵 列的PDMS阳模；
[0018]将液体生物材料倒入所述PDMS阳模上，凝固后剥离，获得具有微孔阵列的生物材料；
[0019]将所述具有微孔阵列的生物材料处理成契合于细胞培养板的外形，后设于所述细胞培 养板上，获得肝脏类器官培养芯片。
[0020]在本专利技术的第三方面，提供了一种采用所述肝脏类器官培养芯片的类器官培养方法， 所述方法包括：
[0021]将常规培养的人胚胎干细胞或人诱导多功能干细胞消化成单个细胞，将所述单个细胞 接种于培养基中培养，获得前肠胚细胞；
[0022]将所述前肠胚细胞消化成单个细胞后接种于所述肝脏类器官培养芯片中的所述微孔阵 列中培养，获得肝脏类器官。
[0023]进一步地，所述单个人胚胎干细胞或人诱导多功能干细胞接种于培养基中培养，获得 前肠胚细胞，包括：
[0024]将所述单个细胞按照1
×
105/cm2接种于第一培养基中培养，所述第一培养基为含有100 ng/mL ActivinA和50ng/mL BMP4的RPMI培养基；(所述RPMI培养基含有1％Pen/Strep 和25mM Hepes，下同)；
[0025]所述培养第二天换成第二培养基，所述第二培养基为：含有100ng/mL ActivinA和0.2％ Knockout serum replacement的RPMI培养基；
[0026]所述培养第三天换成第三培养基培养，获得内胚层细胞，所述第三培养基为：含有100 ng/mL Activin A和2％Knockout serum replacement的RPMI培养基；RPMI培养基培养基(含 有1％B27、1％N2、10mM Hepes、1％Glutamax、1％Gentamycin/Amphotericin solution， 下同)；
[0027]将所述内胚层细胞采用第四培养基培养1～3天，获得前肠胚细胞；其中，所述第四培 养基为：含有500ng/mL的FGF2和3μM CHIR99021的Advanced DMEM/F12。
[0028]进一步地，所述前肠胚细胞接种于所述肝脏类器官培养芯片中的所述微孔阵列中培养， 获得肝脏类器官，包括：
[0029]将所述前肠胚细胞消化成单个细胞，按照200/孔接种于所述肝脏类器官培养芯片中的 所述微孔阵列中，用含有80ng/mL FGF2和3μM CHIR99021的Advanced DMEM/F12培养 基维持培养，获得肝脏类器官。
[0030]上述技术方案中，肝脏类器官的类型包括但不限于PSC或者EB来源的肝脏类器官、 成体干细胞来源的肝脏类器官、肝脏相关的肿瘤类器官。
[0031]本专利技术实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
[0032]本专利技术提供的一种肝脏类器官培养芯片及其制备方法与应用，适用于不同来源或者是 不同组织类型的均一且高通量的肝脏类器官培养，微孔阵列可匹配各种市售的培养器皿， 充分考虑生物学家的操作习惯，降低学习成本，具有很高的用户友好性。此外，微孔阵列 与现有的细胞培养孔板高度结合，对现有的生物分析及成像仪器均有良好的兼容性；具体 地：
[0033](1)本专利技术提供的一种肝脏类器官培养芯片，首次采用具有微孔阵列的生物材料应用 于肝脏类器官的培养，所述生物材料包括琼脂糖、聚乙二醇和海藻酸钠中的至少一种；采 用所述生物材料具有生物相容性好、良好的光学通透性和易成型的优点。
[0034](2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肝脏类器官培养芯片，其特征在于，包括：细胞培养板；具有微孔阵列的生物材料，设于所述细胞培养板内；其中，所述生物材料包括琼脂糖、聚乙二醇和海藻酸钠中的至少一种；所述生物材料上设有多个微孔，且多个所述微孔均匀排列形成所述微孔阵列。2.根据权利要求1所述的一种肝脏类器官培养芯片，其特征在于，每个所述微孔的深度为0.1mm～5mm。3.根据权利要求1所述的一种肝脏类器官培养芯片，其特征在于，相邻两个所述微孔之间距离为10μm～1mm。4.根据权利要求1所述的一种肝脏类器官培养芯片，其特征在于，每个所述微孔的面积为78.00μm2～78.5mm2。5.根据权利要求1所述的一种肝脏类器官培养芯片，其特征在于，所述生物材料为0.5％～10％的琼脂糖。6.根据权利要求1所述的一种肝脏类器官培养芯片，其特征在于，所述细胞培养板包括96孔板、48孔板、24孔板、12孔板、6孔板、3.5cm培养皿、6cm培养皿和10cm培养皿中的一种。7.一种权利要求1
‑
6任一所述肝脏类器官培养芯片的制备方法，其特征在于，所述方法包括：在PMMA上进行制作，获得具有微孔阵列的PMMA阴模；将PDMS倒入所述PMMA阴模上，真空干燥并抽真空，烘干后剥离，获得具有微孔阵列的PDMS阳模；将液体生物材料倒入所述PDMS阳模上，凝固后剥离，获得具有微孔阵列的生物材料；将所述具有微孔阵列的生物材料处理成契合于细胞培养板的外形，后设于所述细胞培养板上，获得肝脏类器官培养芯片。8.一种采用权利要求1
‑
6任一所述肝脏类器官培养芯片的肝脏类器官培养方法，其特征在于，所述方法包括：将常规培养的人胚胎干细胞或人诱导多功能干细胞消化成单个细胞，将所述单个细胞接种于培养基中培养，获得前肠胚细胞；将所述前肠胚细胞接种于所述肝脏类器官培养芯...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈璞，江善青，谷龙军，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：