一种生物体内纳米污染物的成像检测方法技术

本发明专利技术提供了一种生物体内纳米污染物的成像检测方法，利用具有特征拉曼指纹的有机小分子与纳米污染物结合，配合合适的生物固定方法，可以很好地检测出生物体内的纳米污染物，并观察到污染物的空间分布。本发明专利技术的方法可实现生物体内纳米污染物的快速、原位和定量分析，真实地反映环境中生物体内纳米污染物的分布，揭示纳米污染物在实际环境中的迁移转化过程，从而评估纳米污染物的生物安全风险。从而评估纳米污染物的生物安全风险。

【技术实现步骤摘要】
一种生物体内纳米污染物的成像检测方法


[0001]本专利技术涉及纳米污染物分析检测领域，尤其涉及一种生物体内纳米污染物的成像检测方法。

技术介绍

[0002]纳米材料具有优异的光、电、热、磁等性能，在生物医疗、电子器件、环境修复和食品包装等行业广泛应用。然而，大量的纳米材料在使用后会进入到环境中，对环境水体和生物造成潜在毒性，在环境中的浓度可达到ppb
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ppm量级。目前检测生物体内纳米材料的方法主要包括：扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)、纳米级二次离子质谱(nanoSIMS)、激光烧蚀电感耦合等离子体质谱(LA
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ICP
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MS)和荧光显微镜等。但这些方法需要对样品进行复杂的前处理(例如荧光修饰)，无法进行原位检测，并且对样品大小有一定要求，无法检测多种纳米污染物，无法实现方便快捷的成像检测，且荧光修饰会改变纳米材料的表面性质，进而影响其在生物体内的真实分布。
[0003]表面增强拉曼光谱(SERS)是一种利用贵金属(Au、Ag、Pt等)的表面等离子体共振效应，来增强其表面物质拉曼信号的检测方法。SERS具有原位、快速检测、生物相容性好、样品处理简单等优点。在医学癌症治疗、生物传感和食品安全检测等领域广泛应用。
[0004]将SERS技术应用到环境领域，可检测环境水体中纳米污染物在生物体内的分布迁移过程，研究纳米污染物的生物毒性，并评估纳米污染物的生物安全风险。但环境中纳米颗粒种类复杂，形貌大小多样，难以构建相应SERS体系进行检测。所以目前尚未开发出利用SERS检测生物体内纳米污染物的方法。

技术实现思路

[0005]针对上述现有技术所存在的问题，本专利技术提供了一种生物体内纳米污染物的成像检测方法，该检测方法可以快速原位地检测出生物体内的多种纳米污染物，并观察到纳米污染物在生物体内的空间分布。本专利技术可真实地反映环境中生物体内纳米污染物的分布，实现生物体内纳米污染物的快速、原位和定量分析，评估纳米污染物的生物安全风险。
[0006]本专利技术为解决技术问题，采用如下技术方案：
[0007]一种生物体内纳米污染物的成像检测方法，包括以下步骤：
[0008](1)在纳米颗粒表面先包裹拉曼活性分子，再包裹待检测的纳米污染物，获得核壳结构纳米污染物；
[0009]将所述核壳结构纳米污染物加入到生物培养液中，进行培养，使生物体内摄入核壳结构纳米污染物；培养结束后，将受污染生物取出并固定在载玻片上，得到预处理样品；
[0010](2)用激光显微拉曼光谱仪对所述预处理样品进行拉曼检测与成像，得到预处理样品的拉曼光谱；然后根据所述拉曼活性分子的特征峰，对所述拉曼光谱通过成像软件进行处理，得到纳米污染物的拉曼成像图，即可获得纳米污染物在生物体内的空间分布。在所述拉曼成像图中，不同的颜色代表纳米污染物在该点的丰度，所得拉曼图与生物光学照片
相叠加，即可得到纳米污染物在生物体内的空间分布。
[0011]进一步地，所述纳米颗粒为金纳米颗粒或银纳米颗粒。
[0012]进一步地，所述拉曼活性分子为结晶紫、罗丹明6G、DTTC、DTDC、IR
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775氯化物、对硝基苯硫酚、对氨基苯硫酚和对苯二硫酚中的至少一种。拉曼活性分子的选择是非常重要的：首先拉曼分子可以很好地结合在纳米颗粒表面，并与纳米污染物结合；另外，需要选择特定的拉曼分子使纳米污染物可以均匀的生长在纳米颗粒表面，保证拉曼分子的稳定性及纳米颗粒的形貌均一。本专利技术利用具有特征拉曼指纹的有机小分子与纳米污染物结合，可以很好地检测出生物体内的纳米污染物，并观察到污染物的空间分布。
[0013]进一步地，所述纳米污染物为Ag、SiO2、TiO2、MnO2和纳米塑料中的至少一种。
[0014]进一步地，所述生物为植物(如紫背浮萍等)、微生物(大肠杆菌等)或动物(如线虫等)。
[0015]进一步地，所述核壳结构纳米污染物的制备方法为：
[0016]步骤1、将待检测纳米污染物的前驱体溶解在溶剂中，获得前驱体溶液；
[0017]步骤2、将纳米颗粒分散在含表面稳定剂的溶剂中，获得纳米颗粒分散液；然后再加入拉曼活性分子分散液，25
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50℃搅拌20min
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2h，离心、洗涤，加含表面稳定剂的溶剂重悬至原始体积，获得纳米颗粒/拉曼活性分子分散液；
[0018]步骤3、在所述纳米颗粒/拉曼活性分子分散液中加入所述前驱体溶液，水热反应，离心、洗涤、用水分散，即获得核壳结构纳米污染物。
[0019]进一步地，水热反应的条件以及表面稳定剂、溶剂、前驱体的类型根据待检测纳米污染物的类型确定，如：当所述纳米污染物为Ag时，水热反应温度为70℃、时间为3h，表面稳定剂为十六烷基三甲基氯化铵，溶剂为水，前驱体为硝酸银和抗坏血酸；当所述纳米污染物为SiO2时，水热反应温度为25℃、时间为36h，表面稳定剂为3
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氨基丙基三乙氧基硅烷或3
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巯丙基三甲氧基硅烷，溶剂为乙醇，前驱体为正硅酸乙酯；当所述纳米污染物为TiO2时，水热反应温度为25℃、时间为1h，表面稳定剂为十六烷基三甲基氯化铵，溶剂为水，前驱体为钛酸丁酯；当所述纳米污染物为MnO2时，水热反应温度为25℃、时间为0.5h，表面稳定剂为聚乙烯吡咯烷酮，溶剂为水，前驱体为高锰酸钾；当所述纳米污染物为纳米塑料时，水热反应温度为70℃、时间为1.5h，表面稳定剂为十二烷基磺酸钠，溶剂为水，前驱体为二乙烯基苯和苯乙烯。
[0020]进一步地：所述前驱体溶液的浓度为5
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50mM；所述含表面稳定剂的溶剂中表面稳定剂浓度为25
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50mM；所述纳米颗粒分散液中纳米颗粒的浓度为1
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10nM；所述拉曼活性分子分散液的浓度为0.1
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1mM，所用溶剂为乙醇、DMSO和DMF中的至少一种；所述纳米颗粒分散液与所述拉曼活性分子分散液的体积比为10～100:1；所述纳米颗粒/拉曼活性分子分散液与所述前驱体溶液的体积比为10～100:1。
[0021]进一步地，所述固定的方法为：将受污染生物取出并转移在载玻片上，滴上固定液，4～25℃固定10～60min；所述固定液是由丙三醇或1,2
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丙二醇与水按照质量比1:0～4混合而成。固定液的选择对样品的处理十分关键：需要使样品在固定过程中保持水分，避免生物皱缩，形态变化，影响后续检测；同时固定液的加入不会对生物拉曼信号造成影响，保证生物成像的准确性。
[0022]进一步地，步骤2)中所述拉曼检测的条件为：
[0023]采用633nm或785nm激光，激光能量为10
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100％；
[0024]光栅为600lines/mm或1800lines/mm；
[0025]空间分辨率为1
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50μm/pixel，单像素点采集时本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物体内纳米污染物的成像检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)在纳米颗粒表面先包裹拉曼活性分子，再包裹待检测的纳米污染物，获得核壳结构纳米污染物；将所述核壳结构纳米污染物加入到生物培养液中，进行培养，使生物体内摄入核壳结构纳米污染物；培养结束后，将受污染生物取出并固定在载玻片上，得到预处理样品；(2)用激光显微拉曼光谱仪对所述预处理样品进行拉曼检测与成像，得到预处理样品的拉曼光谱；然后根据所述拉曼活性分子的特征峰，对所述拉曼光谱通过成像软件进行处理，得到纳米污染物的拉曼成像图，即可获得纳米污染物在生物体内的空间分布。2.根据权利要求1所述的成像检测方法，其特征在于：所述纳米颗粒为金纳米颗粒或银纳米颗粒。3.根据权利要求1所述的成像检测方法，其特征在于：所述拉曼活性分子为结晶紫、罗丹明6G、DTTC、DTDC、IR
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775氯化物、对硝基苯硫酚、对氨基苯硫酚和对苯二硫酚中的至少一种。4.根据权利要求1所述的成像检测方法，其特征在于：所述纳米污染物为Ag、SiO2、TiO2、MnO2和纳米塑料中的至少一种。5.根据权利要求1所述的成像检测方法，其特征在于：所述生物为植物、微生物或动物。6.根据权利要求1所述的成像检测方法，其特征在于：所述核壳结构纳米污染物的制备方法为：步骤1、将待检测纳米污染物的前驱体溶解在溶剂中，获得前驱体溶液；步骤2、将纳米颗粒分散在含表面稳定剂的溶剂中，获得纳米颗粒分散液；然后再加入拉曼活性分子分散液，25
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50℃搅拌20min
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2h，离心、洗涤，加含表面稳定剂的溶剂重悬至原始体积，获得纳米颗粒/拉曼活性分子分散液；步骤3、在所述纳米颗粒/拉曼活性分子分散...

【专利技术属性】
技术研发人员：盛国平，周洪志，杨传旺，谢东华，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：