非洲猪瘟病毒抗体快速检测试纸条及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种非洲猪瘟病毒抗体快速检测试纸条，所述试纸条由两条联检试纸条和处理液组成，每个试纸条均包括PVC底板，在PVC底板上按顺序依次固定有样品垫、乳胶微球垫、硝酸纤维素膜以及吸水纸；两条试纸条的乳胶微球垫均为乳胶微球标记非洲猪瘟病毒P30蛋白；两条试纸条的硝酸纤维素膜表面均划有检测线和质控线，其中质控线均为抗非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体，其中之一的检测线为非洲猪瘟病毒P30蛋白，另一个检测线为羊抗猪二抗。本发明专利技术所提供的试纸条适用于猪血清、全血和组织液的检测，其特异性强、灵敏度高、稳定性好、检测速度快，可用于非洲猪瘟病毒的早期筛查，特别适合现场非洲猪瘟感染诊断、流行病学调查和生猪国际贸易检疫检验等。国际贸易检疫检验等。国际贸易检疫检验等。

【技术实现步骤摘要】
非洲猪瘟病毒抗体快速检测试纸条及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于病毒疫病诊断技术和动物检疫领域，具体涉及一种非洲猪瘟病毒抗体快速检测试纸条及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]非洲猪瘟(英文名称：African Swine fever，简称：ASF)是由非洲猪瘟病毒(英文名称：African Swine fevervirus，简称：ASFV)感染家猪和各种野猪(如非洲野猪、欧洲野猪等)引起一种急性、出血性、烈性传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，该病也是我国重点防范的一类动物疫情。其特征是发病过程短，最急性和急性感染死亡率高达100％，临床表现为发热(达40～42℃)，心跳加快，呼吸困难，部分咳嗽，眼、鼻有浆液性或粘液性脓性分泌物，皮肤发绀，淋巴结、肾、胃肠粘膜明显出血，非洲猪瘟临床症状与猪瘟症状相似。
[0003]ASFV是一种双链的核质大DNA病毒(Nucleocytoplasmic Large DNA Viruses,NCLDV)。根据不同的病毒株型，基因组DNA的碱基数约为17万到19万，其中含有151至167个开放阅读框(Opening Reading Frames,ORFs)[Alejo A,Matamoros T,Guerra M,Andr
é
s G.,2018.A Proteomic Atlas of the African Swine Fever Virus Particle.J Virol 92:e01293
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18.]。与其它的NCLDV一样，ASFV编码许多蛋白质，这些蛋白质除了专门用于病毒组装的结构蛋白外，还参与逃避宿主防御机制，诸如I型干扰素和细胞凋亡途径等，以及DNA复制的修复和基因表达的调控的生物学过程。大多数ASFV的基因功能是未知的，仍需要人们对其进行探索。ASFV形态为正二十面体，直径约200纳米，由多层物质构成：中央为内含拟核的蛋白质核壳，由内向外分别还有一层脂质包膜和蛋白质衣壳。衣壳由8280个主要的衣壳蛋白p72和60个戊蛋白构成，此外至少有三种蛋白质通过对临近蛋白的粘连来保持衣壳结构的稳定。
[0004]目前，市场上面没有疫苗用于非洲猪瘟的防控，检测非洲猪瘟抗原成本高、速度慢，不适合大批量快速检测。因此，急需开发一种非洲猪瘟病毒ELISA抗体检测试纸条，用于非洲猪瘟抗体的快速检测，以达到快速筛查是否有非洲猪瘟感染。从而起到非洲猪瘟的防控目的。针对非洲猪瘟抗体检测，试纸条有双抗原夹抗体方法、间接检测方法以及竞争检测方法。但对非洲猪瘟病毒抗体来说，竞争方法不适用(抗原较大，不止一个抗原位点，竞争法容易产生假阴性)。而双抗原夹心方法的敏感性较差，间接检测方法特异性较差。因此，急需开发一种特异性强、敏感性好的快速检测试纸条。

技术实现思路

[0005]为了弥补现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种非洲猪瘟病毒抗体快速检测试纸条。
[0006]因此，本专利技术一方面提供了一种非洲猪瘟病毒抗体快速检测试纸条，所述非洲猪瘟病毒抗体快速检测试纸条由两条联检试纸条和处理液组成，所述两条联检试纸条为合并
在一起的试纸条，每个试纸条均包括PVC底板，在PVC底板上按顺序依次固定有样品垫、乳胶微球垫、硝酸纤维素膜以及吸水纸；两条试纸条的乳胶微球垫均为乳胶微球标记非洲猪瘟病毒P30蛋白；两条试纸条的硝酸纤维素膜表面均划有检测线和质控线，其中质控线均为抗非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体，其中之一的检测线为非洲猪瘟病毒P30蛋白，另一个检测线为兔抗猪IgG。
[0007]优选地，本专利技术所述的非洲猪瘟病毒P30蛋白由CHO细胞株表达，所述非洲猪瘟病毒P30蛋白的相对分子量为36kD，所述非洲猪瘟病毒P30蛋白的编码序列如SEQ ID No.1所示。
[0008]优选地，本专利技术所述的样品处理液为1
×
PBS溶液。
[0009]优选地，本专利技术所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的单克隆抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO.2所示，所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的单克隆抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO.3所示。
[0010]优选地，本专利技术所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的单克隆抗体的抗原表位位于非洲猪瘟病毒P30蛋白的aa77
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aa92位，所述非洲猪瘟病毒P30蛋白的aa77
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aa92位的氨基酸序列为EHQAQEEWNMILHVLF。
[0011]优选地，本专利技术所述的试纸条在检测样本时，当两条试纸条均出现两条条带时，判为阳性；当其中一个出现两条带，一个出现一条质控带时，判为可疑；当两条试纸条均只出现一条质控带时，判为阴性；其他情况判为无效。
[0012]优选地，本专利技术所述的当其中一个出现两条带，一个出现一条质控带时，判为可疑时，需要重新检测；当第二次检测结果均出现两条带时判为阳性，当第二次检测结果仍然是一个出现两条带、一个出现一条质控带时，判为阳性；当第二次检测结果均只出现一条质控带时，判为阴性。
[0013]优选地，本专利技术所述的试纸条适用于检测猪血清、血液和组织液中的非洲猪瘟病毒抗体。
[0014]优选地，本专利技术所述的组织液为唾液。
[0015]优选地，本专利技术所述的组织液为乳汁。
[0016]本专利技术所提供的非洲猪瘟病毒抗体快速检测试纸条适用于猪血清、全血和组织液(如唾液、乳汁)中非洲猪瘟病毒抗体的检测，其特异性强、灵敏度高、稳定性好、检测速度快，可用于非洲猪瘟病毒抗体的早期筛查，特别适合现场非洲猪瘟感染诊断、流行病学调查和生猪国际贸易检疫检验等。
[0017]本专利技术所提供的非洲猪瘟病毒抗体快速检测试纸条集合了双抗原夹抗体和间接检测方法来检测样品中的非洲猪瘟病毒抗体，不仅克服了双抗原夹抗体检测时的敏感性差的问题，还克服了间接检测方法特异性差的问题，实现了非洲猪瘟病毒抗体的准确检测。
[0018]本专利技术用于制备试纸条的非洲猪瘟病毒P30蛋白是采用真核表达体系(CHO系统)制备，适合大规模化发酵生产，成本低(产量高)、质量好(纯度高、真核表达系统，有翻译后修饰功能，与人源的最接近)、批次间稳定性好(同一个细胞株发酵纯化，保证表达蛋白基本一致)。因此，该P30蛋白适用于制备不同的非洲猪瘟病毒诊断试剂，如胶体金、化学发光检测试纸条等。
[0019]本专利技术用于用于制备试纸条的抗体非洲猪瘟病毒P30蛋白的单克隆抗体，对其结
构和识别位点均有公开，且该抗体具有良好的特异性和敏感性，也适用于制备不同的非洲猪瘟病毒诊断试剂，如胶体金、化学发光检测试纸条等。
附图说明
[0020]图1非洲猪瘟病毒P30蛋白SDS
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PAGE电泳图，1是Marker，2是未去糖基化的P30蛋白，3是去除糖基化的P30蛋白。
[0021]图2非洲猪瘟病毒抗体检测试纸条的组装(大板制作)，其中1是样品垫，2是胶体金垫，3是硝酸纤维素膜，4是吸水垫，5是检本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种非洲猪瘟病毒抗体快速检测试纸条，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒抗体快速检测试纸条由两条联检试纸条和处理液组成，所述两条联检试纸条为合并在一起的试纸条，每个试纸条均包括PVC底板，在PVC底板上按顺序依次固定有样品垫、乳胶微球垫、硝酸纤维素膜以及吸水纸；两条试纸条的乳胶微球垫均为乳胶微球标记非洲猪瘟病毒P30蛋白；两条试纸条的硝酸纤维素膜表面均划有检测线和质控线，其中质控线均为抗非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体，其中之一的检测线为非洲猪瘟病毒P30蛋白，另一个检测线为羊抗猪二抗。2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述的非洲猪瘟病毒P30蛋白由CHO细胞株表达，所述非洲猪瘟病毒P30蛋白的相对分子量为36kD，所述非洲猪瘟病毒P30蛋白的编码序列如SEQ ID No.1所示。3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述的样品处理液为1
×
PBS溶液。4.根据权利要求1所述的试纸条，所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的单克隆抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO.2所示，所述的抗非洲猪瘟病毒P30蛋白的单克隆抗体的轻链可变区序列如SEQ ID NO.3所示。5.根据权利要求4所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙统威，徐慧珍，周晶晶，查银河，
申请(专利权)人：杭州恒奥科技有限公司，
类型：发明
国别省市：