一种检测先天性心脏形态缺陷发生相关基因突变的方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种检测先天性心脏形态缺陷发生相关基因突变的方法和试剂盒，是属于基因突变检测技术领域，本发明专利技术的方法和试剂盒使用了两套PCR引物，第一套PCR引物包括168对PCR引物，分两组，第一组包括引物84对(SEQID NO.5

【技术实现步骤摘要】
一种检测先天性心脏形态缺陷发生相关基因突变的方法和试剂盒


[0001]本专利技术属于基因突变检测
，具体涉及一种检测先天性心脏形态缺陷发生相关基因突变的方法和试剂盒。

技术介绍

[0002]心脏是人体胚胎发育过程中形成的第一个器官，从胚胎干细胞向心肌细胞分化的整个过程，需要骨形态发生蛋白(BMP)、WNT、NOTCH、 NODAL等多种信号通路共同参与调控，在整个心脏发育过程中呈现着复杂而精密的交互作用，这些信号通路通过调节心脏发育相关转录因子的表达水平，例如GATA家族、NKX家族、TBX家族等，进而影响心脏发育过程。从上游信号通路到下游转录因子的任意质量或数量的变化，都有可能使心脏不能正常发育，从而发生先天性心脏病(CHD)。多项基于全基因组关联性分析的研究也表明涉及BMP、WNT、NOTCH、 NODAL信号通路和GATA家族、NKX家族、TBX家族转录因子的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)与CHD的发生讯在相关性。针对相关SNP的研究为疾病的早期诊断提供了理论依据。 SNP由于其分布广、密度高而被认为是第三代遗传标志，已有多项涉及心脏形态发生相关基因SNP的研究为评估CHD的发病风险提供理论依据。但是由于目前与心脏形态发生相关的基因及SNP较多，单个位点的检测对CHD发病风险的评估显得十分有限。
[0003]基因PANEL是一个基因组合，在基因检测中使用基因PANEL所检测的基因比单一的位点要多，比PCR技术检测的序列要长，相对来说，在检测中不只是检测一个位点、一个基因，而是同时检测多个位点、多个基因。这些位点和基因需要按照一个标准进行选择和组合，从而构成一个检测PANEL，从而使获得的基因信息量相对要多一些。相较于单个SNP的检测，多基因的检测对于从基因层面上评估叶酸代谢水平更具有全面性。
[0004]目前，应用于心脏形态发生相关的基因突变检测谱仅限于某一单一通路或者某一转录因子家族，而忽略了其他相关基因的累加效应，对于评估CHD这种复杂遗传病的发生风险来说是有局限性的。另外，目前广泛应用的检测方法主要为限制小片段长度多态性分析法(RFLP 法)和DNA直接测序法RFLP法是将PCR与限制性酶切相结合的方法，该方法存在以下缺点：实验操作繁琐、检测周期长、成本高、存在第一轮酶切不完全导致的假阳性、非闭管操作、易于污染、难以满足临床检测要求。DNA直接测序法存在以下缺点：检测周期较长、成本高、非闭管操作、难以避免交叉污染、通量不高。另外，DNA直接测序的灵敏度较低，杂合突变、胶压缩、GC富集区的存在等问题使得很难通过一次测序获得精确的数据，通常需要多次重复测序才可能避免假阳性等，因此直接测序方法也难适用于临床检测。
[0005]因此，本领域需要可用于覆盖面更广、灵敏度更高、位点靶向性更强、检测成本更低的心脏形态发生相关的基因突变的方法和试剂盒。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题在于，针对现有基因突变检测谱仅限于某一单一通路或者某一转录因子家族，而忽略了其他相关基因的累加效应，对于评估CHD这种复杂遗传病的发生风险来说是有局限性的，从而提出一种检测先天性心脏形态缺陷发生相关基因突变的方法和试剂盒。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：
[0008]一种检测先天性心脏形态缺陷发生相关基因突变的方法和试剂盒，所述方法包括：
[0009]1)捕获：进行第一轮特异性多重PCR反应，使用168对引物对样品DNA进行扩增，所述168对PCR引物分两个试管进行反应，第一个试管引物84对SEQ ID NO.5
‑
SEQ ID NO.172，第二个试管引物84 对SEQ ID NO.173
‑
SEQ ID NO.340，每个上游引物的5
’
端添加序列 SEQ ID NO.1，每个下游引物的5
’
端添加序列SEQ ID NO.2；
[0010]2)建库：进行第二轮PCR反应，使用PCR引物对：上、下游引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4对步骤1)获得的扩增产物进行扩增；
[0011]3)测序，对步骤2)获得的扩增产物进行测序；
[0012]4)分析，对步骤3)获得的测序结果进行分析，完成全编码区的突变检测。
[0013]2.一种心脏形态发生相关基因突变多重PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括两套PCR引物，第一套PCR引物包括168对PCR引物，168 对PCR引物分为两组，第一组包括引物84对 SEQ ID NO.5
‑
SEQ ID NO.172，第二组包括引物84对 SEQ ID NO.173
‑
SEQ ID NO.340，第一套PCR引物的每个上游引物的5
’
端添加序列SEQ ID NO.1，第一套PCR引物每个下游引物的5
’
端添加序列SEQ ID NO.2；第二套PCR引物的上、下游引物序列分别是SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
[0014]所述试剂盒还包括PCR扩增预混合溶液。
[0015]所述试剂盒还包括水。
[0016]所述的试剂盒中，第一套引物的PCR反应的反应体系按如下比例配制：第一套PCR引物10份、PCR扩增预混合溶液12.5份、DNA模板3份、水4.5份。
[0017]所述的试剂盒中，第二套PCR反应的反应体系按如下比例配制： PCR引物2.5份、PCR扩增预混合溶液7.5份、第一轮PCR回收产物 5份、水4.5份。
[0018]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0019]1)地毯式引物设计，可实现全编码区突变检测，不但能对已知突变进行分析，还能发现新的突变；对待检测样品要求量低，可对血浆和血清中的极低DNA样品进行分析；灵敏度高；检测时间短，结合高通量测序技术，可短时间内实现全编码区突变检测；成本低廉。
[0020]2)试剂盒可用于高灵敏度、高通量、低成本检测心脏形态发生相关基因突变，协助临床医生实现肿瘤病人的个体化治疗，降低治疗风险以及患者负担。
附图说明
[0021]图1为第二轮PCR C01反应毛细管电泳基因分析系统鉴定结果。
[0022]图2为第二轮PCR C02反应毛细管电泳基因分析系统鉴定结果。
[0023]图3为第二轮PCR C03反应毛细管电泳基因分析系统鉴定结果。
具体实施方式
[0024]下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本专利技术，在此本专利技术的示意性实施例以及说明来解释本专利技术，但并不作为对本专利技术的限定。
[0025]本专利技术提供了一种检测心脏形态发生相关基因突变的方法，虽然在某些情况下，对这些基因的检测对于相关癌症的诊断、预防和治疗有重要的辅助意义，但这些基因的突变不是必然导致所述疾病耐药的发生，因此对这些基因的检测并不涉及疾病的诊断或治疗方法。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测先天性心脏形态发生相关基因突变的方法，其特征在于，所述方法包括：1)捕获：进行第一轮特异性多重PCR反应，使用168对引物对样品DNA进行扩增，所述168对PCR引物分两个试管进行反应，第一个试管引物84对SEQ ID NO.5
‑
SEQ ID NO.172，第二个试管引物84对SEQ ID NO.173
‑
SEQ ID NO.340，每个上游引物的5
’
端添加序列SEQ ID NO.1，每个下游引物的5
’
端添加序列SEQ ID NO.2；2)建库：进行第二轮PCR反应，使用PCR引物对：上、下游引物SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4对步骤1)获得的扩增产物进行扩增；3)测序，对步骤2)获得的扩增产物进行测序；4)分析，对步骤3)获得的测序结果进行分析，完成全编码区的突变检测。2.一种心脏形态发生相关基因突变多重PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括两套PCR引物，第一套PCR引物包括168对PCR引物，168对PCR引物分为两组，第一组包括引物84对SEQ ID NO.5
‑
SEQ ID NO.172，第二组包括引物84对SEQ ...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢小冬，谢寒晖，杨文珂，张莎莎，
申请(专利权)人：谢小冬，
类型：发明
国别省市：