Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白及其制备方法技术

本发明专利技术涉及Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白，所述融合蛋白由目标抗体的Fab片段和小牛肠碱性磷酸酶由连接肽链接构成，编码小牛肠碱性磷酸酶的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示，其中目标抗体可选自人源抗体，鼠源抗体，羊源抗体，兔源抗体，马源抗体，鸡源抗体或嵌合抗体。本发明专利技术将Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶在哺乳动物细胞中融合表达，既能克服化学标记方法的各种缺陷，又可获取高比活酶标抗体。所制备的融合蛋白可应用于免疫诊断领域，如化学发光免疫法，酶联免疫吸附法或酶促荧光免疫法等。酶联免疫吸附法或酶促荧光免疫法等。酶联免疫吸附法或酶促荧光免疫法等。

【技术实现步骤摘要】
Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白及其制备方法


[0001]本专利技术属于分子生物
，涉及Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白，还涉及该融合蛋白的其制备方法。

技术介绍

[0002]碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)是一种专一性较广的磷酸酯水解酶，可以催化磷酸单脂的水解和磷酸基团的转移反应，在生物体内具有重要的生理功能。除此之外，碱性磷酸酶做为酶缀合物可应用于诊断领域，如基于抗原抗体反应的免疫诊断检测系统，比如化学发光平台或酶联免疫平台，或使DNA脱磷酸化。目前已知的天然AP中，比活性最高的是源自牛肠的碱性磷酸酶。小牛肠碱性磷酸酶天然蛋白或重组蛋白广泛应用于免疫诊断以及分子诊断领域，如酶促化学发光免疫诊断领域。其中酶标记步骤是制备诊断试剂过程中的关键步骤，将碱性磷酸酶标记相关分子(如抗原、抗体或小分子)，结合靶分子后，与碱性磷酸酶底物反应脱磷酸基团，从而氧化发光，通过测量发光强度定量靶分子浓度。
[0003]目前免疫酶标试剂制备方式是采用化学标记方法，如使用双功能试剂，戊二醛，过碘酸盐，SMCC试剂{4
‑
(N
‑
马来酰亚胺基甲基)环己烷
‑1‑
羧酸琥珀酰亚胺酯等)}，2
‑
IT试剂(亚氨基噻吩盐酸盐)等，将抗体与酶偶联，但是化学偶联方法操作复杂，偶联效率低，由于偶联位点不固定且条件剧烈，易导致抗体或酶活性降低，抗体与酶的结合物不均一，需要分离去除未结合的酶和抗体，且去除未结合的抗体至关重要，因为游离的抗体会与酶标记抗体竞争相应的抗原，减低结合到固相上的酶标抗体量，因而降低了检测的灵敏度。
[0004]Fab抗体又为抗原结合片段(Antigen
‑
binding fragment)，由完整的轻链(可变区和恒定区)和部分重链结构(可变区和一个恒定区片段)组成，轻链与重链通过一个二硫键连接。每一个Fab相当于“Y”字形抗体的左臂或右臂，体积较小(分子量47
‑
48kDa)。
[0005]由于Fab同时具备了抗原结合区和部分恒定区，使其不仅具备了亲本抗体一样的抗体
‑
抗原亲和力、而且具有单链抗体(scFv)优秀的组织穿透力等，相比于单链抗体(scFv)拥有更稳定的结构，从而在临床诊断和治疗上发挥巨大的作用。
[0006]运用基因工程方法，重组表达抗体与碱性磷酸酶融合蛋白是较好的方式，可以替代传统化学偶联方法。已报道的方法，多选用大肠杆菌碱性磷酸酶与葡萄球菌蛋白A或ScFv在大肠杆菌或酵母细胞中融合表达，用于ELISA(酶联免疫吸附测定法)。但是大肠杆菌表达的碱性磷酸酶比活低，无法应用于发光免疫分析。大肠杆菌表达Fab抗体、或Fab抗体与碱性磷酸酶融合蛋白缺乏翻译后修饰，如糖基化对维持碱性磷酸酶活性重要，且易形成不溶性包涵体，需要对包涵体蛋白进行变复性，难以获取高活性Fab抗体与碱性磷酸酶融合蛋白。葡萄球菌蛋白A与碱性磷酸酶融合蛋白虽然可以结合IgG抗体，形成碱性磷酸酶标记抗体，但同样可以结合包被抗体，对免疫分析实验造成干扰。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种涉及Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的
融合蛋白，本专利技术的目的之二在于还提供Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白的其制备方法。
[0008]为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0009]1.Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白，所述融合蛋白由目标抗体的Fab片段和小牛肠碱性磷酸酶由连接肽链接构成，编码小牛肠碱性磷酸酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0010]进一步，所述Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白中，目标抗体选自人源抗体，鼠源抗体，羊源抗体，兔源抗体，马源抗体，鸡源抗体或嵌合抗体。
[0011]进一步，所述Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白中，所述嵌合抗体选自人鼠嵌合抗体，人兔嵌合抗体或鼠兔嵌合抗体。
[0012]进一步，在本专利技术的Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白中，目标抗体为鼠源抗体CA724
‑
B72.3。
[0013]进一步，所述Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白中，所述连接肽为柔性连接肽或刚性连接肽，所述柔性连接肽为(GGGGS)n或(GGGS)n，刚性连接肽为A(EAAAK)nA，n为3,4,5,6,7,8之一。
[0014]进一步，所述Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白中，所述柔性连接肽为(GGGGS)4。
[0015]2、Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白的制备方法，具体制备方法的步骤如下：
[0016]a.根据目标抗体的VL
‑
CL和VH
‑
CH1核苷酸序列，连接肽核苷酸序列，小牛肠碱性磷酸酶的核苷酸序列，采用重叠PCR技术合成基因，合成后酶切基因，分别连接到载体上；
[0017]b.将构建后的重组载体转染到哺乳细胞中，经培养细胞后，即可在细胞培养液上清得到Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白。
[0018]进一步，Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白的制备方法中，步骤b中哺乳细胞为CHO细胞，HEK293细胞，Expi293细胞，COS7细胞，NSO细胞或BHK21细胞。
[0019]进一步，Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白的制备方法中，所述载体为pCDNA/GS载体，重组载体转染到哺乳细胞后还包括步骤c，将用抑制剂加压筛选表达高活性蛋白的克隆，再采用批培养，Fed
‑
batch培养筛选，结合高通量酶活鉴定方法，获取高表达Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白稳定细胞株，继续放大Fed
‑
batch培养生产，10
‑
14天后收集上清。
[0020]进一步，Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白的制备方法中，步骤b中培养细胞时，培养基中含有2mM MgCl2,0.1mM ZnCl2。
[0021]进一步，Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白的制备方法中，还包括步骤d蛋白纯化，收集细胞培养液上清，加入50
‑
55％硫酸铵沉淀，沉淀溶解于缓冲液A中，经Phenyl HP疏水层析，洗脱蛋白再经DEAE弱阴离子交换层析，最后得到的高活性Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白。
[0022]3、由以上方法制备的Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白在免疫检测试剂中的应用也属于本专利技术所保护的范围。
[0023]本专利技术的有益效果在于：本专利技术将Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶在哺乳动物细胞
中融合表达，既能克服化学标记方法的各种缺陷，又可获取高比活酶标抗体。所制备的融合蛋白可应用于免疫诊断领域，如化学发光免疫法，酶联免疫吸附法或酶促荧光免疫法等作检测试剂用。相比较传统的化学偶联碱性磷酸酶方式，所表达的Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶融合蛋白，具有如下本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白由目标抗体的Fab片段和小牛肠碱性磷酸酶由连接肽链接构成，编码小牛肠碱性磷酸酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。2.根据权利要求1所述Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白，其特征在于，目标抗体选自人源抗体，鼠源抗体，羊源抗体，兔源抗体，马源抗体，鸡源抗体或嵌合抗体。3.根据权利要求2所述Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白，其特征在于，所述嵌合抗体选自人鼠嵌合抗体，人兔嵌合抗体或鼠兔嵌合抗体。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述连接肽为柔性连接肽或刚性连接肽，所述柔性连接肽为(GGGGS)n或(GGGS)n，刚性连接肽为A(EAAAK)nA，n为3,4,5,6,7,8之一。5.权利要求1
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4任一项所述Fab抗体与小牛肠碱性磷酸酶的融合蛋白的制备方法，其特征在于，具体制备方法的步骤如下：a.根据目标抗体的VL
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CL和VH
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CH1核苷酸序列，连接肽核苷酸序列，小牛肠碱性磷酸酶的核苷酸序列，采用重叠PCR技术合成基因，合成后酶切基因，分别连接到载体上；b.将构建后的重组载体转染到哺乳细胞中，经培养细胞后，即可在细胞培养液上清得到Fab...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭清红，田翀，任俊英，
申请(专利权)人：金标优尼科无锡生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：