本发明专利技术涉及医学检测和免疫分析技术领域，涉及一种干式免疫荧光层析法甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒，包括检测卡、检测芯片和检测缓冲液；检测卡包括试剂条，试剂条包括吸水纸、硝酸纤维素膜、结合垫和样品垫；硝酸纤维素膜上依次包被有质控C线、检测T1线和检测T2线；结合垫上固相有荧光物质标记的鼠抗人甲型/乙型流感病毒单克隆抗体形成的荧光抗体，能够简便、快速、准确地检测甲型/乙型流感病毒抗原。本发明专利技术采用免疫荧光双抗体夹心法检测样本中的流感病毒抗原，与现有方法相比，操作更加简单便捷、节省人力物力且灵敏度高，无需专业人员操作，荧光免疫定量分析仪可直接出检测结果，适合各级医疗单位使用，易推广，具有广泛的适用性。适用性。
【技术实现步骤摘要】
一种干式免疫荧光层析法甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒
[0001]本专利技术涉及医学检测和免疫分析
，具体涉及一种干式免疫荧光层析法甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒。
技术介绍
[0002]流感病毒分甲、乙、丙三型，甲型流感病毒威胁最大，乙型次之。依据血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白抗原性的不同，甲型流感病毒目前可分为15个H亚型(H1
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H15)和9个N亚型(N1
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N9)。由于编码HA或NA的核酸序列容易发生突变，致使HA或NA的抗原表位发生改变，这种抗原性的转变使人群原有的特异性免疫力失效，故甲型流感病毒常引起较大规模甚至世界性的流感流行。
[0003]流感病毒作为一类致病率极高的上呼吸道感染病毒，在全世界的发病人群可达80～90％，其中易感人群多为老年人和婴幼儿。流感病人临床症状表现为急起高热、全身酸痛、乏力，并常常引起上呼吸道感染，有些导致支气管炎、支气管肺炎等并发症。该病潜伏期短，传染性强，传播迅速，由于流感病毒致病力强，易发生变异，若人群对变异株缺乏免疫力，易引起暴发流行，给人类的健康与生活造成严重危害，同时也对社会公共防疫系统构成了极大的威胁，因此流感病毒已经成为流行病学的主要研究对象之一。近年来随着一些抗流感病毒药的上市，对流感病毒进行准确检测也已经成为药物使用的重要基础。
[0004]目前对于流感病毒的确认一般采用鸡胚或MDCK细胞分离培养和血凝抑制法，但是其操作繁琐且费时费力，难以满足快速诊断的需要。随着快速诊断技术的发展和应用，目前市场上流感病毒的检测产品类型基本可以分为三大类：核酸诊断类(RT
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PCR法)、酶联免疫吸附法(ELISA法)和胶体金免疫层析法。其中RT
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PCR法是首选的诊断方法，准确度最高，但缺点是检测成本高，检测时间长，对实验室不同反应条件空间要求相互独立，且需专业人员通过设备进行操作，具有一定的局限性，不适合大规模检测应用；ELISA法兼顾速度和准确性，是医院检验科和疾控系统实验室的经典方法；胶体金法速度最快，简便易行，适合于普遍筛查，但胶体金检测的灵敏度较低，往往会造成漏检。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的在于解决现有技术中存在的上述问题，提出了一种干式免疫荧光层析法甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒，能够简便、快速、准确地检测甲型/乙型流感病毒抗原，实现快速分型诊断。本专利技术采用免疫荧光双抗体夹心法检测样本中的流感病毒抗原，与现有方法相比，操作更加简单便捷、节省人力物力且灵敏度高，无需专业人员操作，荧光免疫定量分析仪可直接出检测结果，适合各级医疗单位使用，易推广，具有广泛的适用性。
[0006]本专利技术的技术方案是：
[0007]一种干式免疫荧光层析法甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒，包括检测卡、检测芯片和检测缓冲液；所述检测卡包括试剂条，所述试剂条包括吸水纸、硝酸纤维素膜、结合
垫和样品垫；所述硝酸纤维素膜上依次包被有质控C线、检测T1线和检测T2线；所述结合垫上固相有荧光物质标记的0.1～0.5mg/ml(包括0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml)的鼠抗人甲型/乙型流感病毒单克隆抗体形成的荧光抗体；所述检测缓冲液为10mM PBS+0.5～2wt％BSA+0.01～0.05wt％酪蛋白+0.1～0.5wt％S9+0.5wt％PC300。
[0008]进一步的，所述荧光物质标记工艺包括以下步骤：
[0009](1)采用双蒸水制备25～50mM MES活化缓冲液并调节PH至5.8～6.2，优选调节至6.0；取制备的MES活化缓冲液调节PH至6.3～6.8制备偶联缓冲液，优选调节至6.5；MES活化缓冲液浓度包括25mM、30mM、35mM、40mM、45mM以及50mM；
[0010](2)将荧光微球和MES活化缓冲液采用1:10体积比进行混匀，超声确保荧光微球呈单分散状态，制得微球悬浮液；荧光微球优选为0.22μM荧光微球；
[0011](3)称取适量EDC和一定体积的MES活化缓冲液，充分混匀，制备浓度为10～20mg/mL的EDC溶液；此处浓度优选10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL；
[0012](4)称取适量Sulfo
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NHS和一定体积的MES活化缓冲液，充分混匀，制备浓度为10～20mg/mL的Sulfo
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NHS溶液；浓度优选10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL；
[0013](5)向步骤(2)中的微球悬浮液中先后快速加入100～500uL的EDC溶液和100～500uL的Sulfo
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NHS溶液，超声并混合孵育20～60min，活化微球，得到活化后微球溶液；所加入具体体积包括100uL、200uL、300uL、400uL、500uL；混合孵育时间可为30min、40min或50min；
[0014](6)将步骤(5)活化后微球溶液离心，去除上清，加入偶联缓冲液洗涤微球并充分混匀；将混匀后的溶液再次离心，去除上清，然后利用偶联缓冲液将微球重悬，超声，确保微球呈单分散状态，得到微球悬液；
[0015](7)分别移取一定体积的微球悬液加入到偶联缓冲液制备的1～4mg/mL(优选2mg/mL)的鼠抗人甲型流感病毒单克隆抗体溶液和偶联缓冲液制备的1～4mg/mL(优选2mg/mL)的鼠抗人乙型流感病毒单克隆抗体溶液中，超声并混合孵育2～6h，进行抗体偶联；
[0016]制得的微球悬液中鼠抗人甲型流感病毒单克隆抗体溶液的浓度为0.1～0.5mg/mL，优选的，浓度为0.4mg/mL；制得的微球悬液中鼠抗人乙型流感病毒单克隆抗体溶液的浓度为0.1～0.5mg/mL，优选的，浓度为0.2mg/mL；
[0017](8)向步骤(7)的溶液中加入终浓度为100mM的甘氨酸终止反应，混合孵育20～60min，优选混合孵育时间为30min；然后将混合后的溶液离心，去除上清，加入含0.5～5wt％酪蛋白的25mM Tris封闭缓冲液重悬，充分混匀；重悬后的溶液再次离心，去除上清，加入25mM Tris+0.5～5wt％酪蛋白封闭缓冲液重悬，超声，混合孵育1.5～2.5h进行封闭反应；此处，封闭缓冲液混合孵育时间优选2h；
[0018](9)制备微球保存液，包括25mM Tris+0.5wt％BSA+0.2wt％酪蛋白+1wt％海藻糖+0.01wt％NaN3；将步骤(8)的溶液离心后去除上清，微球保存液重悬，超声确保微球呈单分散状态，置于4℃保存。
[0019]进一步的，所述超声均采用探入式超声，混合孵育方式为采用转盘式混合器进行混合孵育；所述离心转速为12000～15000rpm，离心时间12～20min，离心温度4℃。离心转速可选为12000rpm、13000rpm、14000rpm或15000rpm中的任一种，离心时间包括12min、15min、1本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种干式免疫荧光层析法甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂盒，其特征在于，包括检测卡、检测芯片和检测缓冲液；所述检测卡包括试剂条，所述试剂条包括吸水纸、硝酸纤维素膜、结合垫和样品垫；所述硝酸纤维素膜上依次包被有质控C线、检测T1线和检测T2线；所述结合垫上固相有荧光物质标记的0.1～0.5mg/ml的鼠抗人甲型/乙型流感病毒单克隆抗体形成的荧光抗体；所述检测缓冲液为10mM PBS+0.5～2wt％BSA+0.01～0.05wt％酪蛋白+0.1～0.5wt％S9+0.5wt％PC300。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光物质标记工艺包括以下步骤：(1)采用双蒸水制备25～50mM MES活化缓冲液并调节PH至5.8～6.2；取制备的MES活化缓冲液调节PH至6.3～6.8制备偶联缓冲液；(2)将荧光微球和MES活化缓冲液采用1:10体积比进行混匀，超声确保荧光微球呈单分散状态，制得微球悬浮液；(3)称取适量EDC和一定体积的MES活化缓冲液，充分混匀，制备浓度为10～20mg/mL的EDC溶液；(4)称取适量Sulfo
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NHS和一定体积的MES活化缓冲液，充分混匀，制备浓度为10～20mg/mL的Sulfo
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NHS溶液；(5)向步骤(2)中的微球悬浮液中先后快速加入100～500uL的EDC溶液和100～500uL的Sulfo
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NHS溶液，超声并混合孵育20～60min，活化微球，得到活化后微球溶液；(6)将步骤(5)活化后微球溶液离心，去除上清，加入偶联缓冲液洗涤微球并充分混匀；将混匀后的溶液再次离心，去除上清，然后利用偶联缓冲液将微球重悬，超声，确保微球呈单分散状态，得到微球悬液；(7)分别移取一定体积的微球悬液加入到偶联缓冲液制备的鼠抗人甲型流感病毒单克隆抗体溶液和偶联缓冲液制备的鼠抗人乙型流感病毒单克隆抗体溶液中，超声并混合孵育2～6h，进行抗体偶联；制得的微球悬液中鼠抗人甲型流感病毒单克隆抗体溶液的浓度为0.1～0.5mg/mL，优选的，浓度为0.4mg/mL；制得的微球悬液中鼠抗人乙型流感病毒单克隆抗体溶液的浓度为0.1～0.5mg/mL，优选的，浓度为0.2mg/mL；(8)向步骤(7)的溶液中加入终浓度为100mM的甘氨酸终止反应，混合孵育20～60min；然后将混合后的溶液离心，去除上清，加入含0.5～5wt％酪蛋白的25mM Tris封闭缓冲液重悬，充分混匀；重悬后的溶液再次离心，去除上清，加入25mM Tris+0.5～5wt％酪蛋白封闭缓冲液重悬，超声，混合孵育1.5～2.5h进行封闭反应；(9)制备微球保存液，包括25mM Tris+0.5wt％...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨金红，侯万乐，杨帆，段存英，杨致亭，
申请(专利权)人：青岛汉唐生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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