一种植物成对NLR抗性基因数据库的构建方法及其多物种成对NLR基因数据库技术

本发明专利技术公开了一种植物成对NLR抗性基因数据库的构建方法及其多物种成对NLR基因数据库。所述方法包括从JGI或Ensembl收集目的物种的基因组数据；通过Hmmscan和NLR

【技术实现步骤摘要】
一种植物成对NLR抗性基因数据库的构建方法及其多物种成对NLR基因数据库


[0001]本专利技术涉及一种基因序列数据处理方法，具体涉及植物成对NLR基因数据库的构建方法和多物种成对NLR基因数据库。

技术介绍

[0002]植物是地球生态的重要成员，也是人类生活中不可或缺的重要组成部分。人类的衣、食、住、行往往都离不开植物直接或间接的参与，但植物的生长发育过程并不是一帆风顺的，往往伴随着各种生物胁迫的发生，其中绝大部分的生物胁迫源自于微生物的侵染，它们往往会损害植物生长繁殖，严重时更有可能造成植物的大量减产。
[0003]目前应对病菌侵害的防治措施仍然是以施用农药为主，但农药的使用会对生态造成很大的伤害，一些农药含有持久性有机污染物，这些污染物难以降解，会在土壤中保留数十年，对土壤的质量和生物多样性产生不利影响(Jacobsen and2014)。而农药的残留以及其通过食物链的进一步浓缩则会危害到我们人体的生命健康，尤其是儿童、孕妇和老人等高危人群(Kim et al.,2017)。一些关于农药对人体健康的影响研究表明，农药可能与多种疾病有关，包括癌症、白血病和哮喘等等。因此，为了能够有效的、可持续发展的进行病菌防治，我们必须综合使用多种防治手段，而利用植物自身的抗性控制病害是已知最经济有效且安全的途径之一，植物抗病的分子机制研究、抗病基因的鉴定、克隆和转基因因此成为植物学领域的研究重点。
[0004]植物利用自身抗性抵御病原菌的方式有两种(Jones and Dangl,2006)，首先在病原菌侵染时启动病原菌相关分子模式介导免疫(PAMP
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triggered immunity，PTI)，这一过程涉及对微生物共有的保守特征(Pathogen
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associated molecular pattern，PAMPs)的识别。一旦病原菌无法得到PTI的有效抑制，效应因子介导的免疫反应(Effector
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triggered immunity，ETI)就会被激发。ETI过程需要植物抗病基因(Resistance gene)参与，R基因与病原菌AVR效应因子结合后会诱发感染部位产生超敏性细胞死亡(Hypersensitive cell death)，造成组织坏死以避免病原菌进一步侵染。
[0005]NBS
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LRR基因(又称NLR基因)是植物抗病基因中数量最多分布最广的抗病基因群，一直是植物抗病研究中的关键基因。大部分NLR蛋白都是典型的模块化多结构域蛋白，其核心元件为中央的核苷酸结合位点(Nucleotide binding site，NBS)以及C端的富亮氨酸重复区(Leucine
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rich repeat，LRR)，NBS结构域是NLR蛋白受体活性的开关，通过构象变化控制信号传导(Moffett et al.,n.d.)，而LRR结构域则通常在直接识别病原体效应因子的过程中参与特异性识别(Jia et al.,2000)。除此之外NLR蛋白还包含一个N端的可变结构域，根据该可变结构域的不同又可以将NB
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LRR基因分为两大类：TNL(TIR
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NBS
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LRR)，在N端具有TIR(Tolland inter leukin
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1receptor)结构域；CNL(CC
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NBS
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LRR)，在N端具有一个卷曲螺旋结构(Coiled
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Coil，CC)。然而这些NLR基因却具有如下这些演化特征：其在全基因组分布并不均匀，以集中分布为主，大多成簇分布，同一簇中以串联重复为主；同一NBS
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LRR基因在
不同物种间甚至是同一物种的不同品系之间都存在着很大的核苷酸差异；植物的不同品系间，NLR基因的复制和丢失十分频繁。以上这些特征为植物抗病基因的克隆、分析以及应用均制造了较大的阻碍。
[0006]目前针对植物抗病基因的研究主要集中于重要农作物上的抗性基因单体，对于非被子植物和多基因协作的研究相较之下要少得多。“基因对基因”是关于NLR基因抗性机制最早的假说，即一个基因负责一种病原菌的识别免疫，但越来越多的研究发现这一假说并不完备(Lee et al.,2009；Narusaka et al.,2009；Peart et al.,2005)。许多研究结果表明植物对某些病原菌的免疫需要两个遗传连锁的基因协作才能完成，例如拟南芥中的RRS1和RPS4(Narusaka et al.,2009)，水稻中的Pi5
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1和Pi5
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2(Lee et al.,2009)，烟草中的N和NRG1(Peart et al.,2005)等等。它们被统称为成对NLR基因，在基因组上往往头对头排列。一些研究发现成对NLR基因在转基因育种后不仅具有更广谱持久的抗性，同时能降低抗性提高所造成的抗性成本增加(Deng et al.,2017)，是重要的转基因育种资源。Joshua等人在扫描了十三种水稻亚种的NLR基因后发现有近50％的相邻NLR基因呈头对头排列，显著区别于基因簇内duplication串联重复造成的头对尾排列偏好(Stein et al.,2018)，以上的这些结果暗示NLR基因的成对抗性特征可能是植物抗性机制中的一种重要且普遍的模式，因此对成对NLR基因的深入研究是突破植物抗病研究瓶颈至关重要的一步。
[0007]目前已报道的成对NLR大多数具有以下几点特征：1.基因结构上同时具有NBS和LRR结构域，Sensor常常包含一个特殊结构域如WRKY、NOI等(Nishimura et al.,2015)；2.染色体位置上Helper与Sensor头对头紧邻分布；3.演化上Helper比Sensor更加保守；4.系统发育特征上Helper与Sensor分属进化树的不同枝，具有镜像分布的拓扑关系。本专利技术基于以上这些成对NLR基因的演化特征，通过生物信息学方法，实现了植物中成对NLR基因数据库的构建。

技术实现思路

[0008]针对国内外迄今尚缺乏有效鉴定成对NLR基因数据的现状，本专利技术的目的是提供一种植物成对NLR基因数据库的构建方法。
[0009]为了解决现有技术的问题，本专利技术提供了如下技术方案：本专利技术的一种植物成对NLR抗性基因数据库的构建方法，包括如下步骤：
[0010](1)基础数据的收集：从JGI或Ensembl收集目的物种的基因组序列、蛋白序列以及基因注释信息；
[0011](2)NLR基因和基因簇的鉴定：首先通过Hmmscan和NLR
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parser工具鉴定NLR基因，然后结合NLR基因的基因组注释位置，筛选其中的成簇NLR基因；
[0012](3)特殊结构域的鉴定：通过Hmmscan和Blast工具，分析NLR基因的特殊结构域情况；
[0013](4)成对NLR基因的鉴定：首先基于已报本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种植物成对NLR抗性基因数据库的构建方法，其特征在于包括如下步骤：(1)基础数据的收集：从JGI或Ensembl收集目的物种的基因组序列、蛋白序列以及基因注释信息；(2)NLR基因和基因簇的鉴定：首先通过Hmmscan和NLR
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parser工具鉴定NLR基因，然后结合NLR基因的基因组注释位置，筛选其中的成簇NLR基因；(3)特殊结构域的鉴定：通过Hmmscan和Blast工具，分析NLR基因的特殊结构域情况；(4)成对NLR基因的鉴定：首先基于已报道的成对NLR基因，通过Blast工具在目的物种的成簇NLR基因中搜索Helper同源基因，然后将包含Helper同源基因的NLR基因簇筛选出来通过Clustalw2工具构建系统发育树并通过MEGA7.0工具进行人工检视，最终基于成对NLR基因的演化特征筛得目的物种的成对NLR基因；(5)成对NLR基因的再鉴定：基于(4)搜索到的候选成对NLR基因，重复步骤(4)中的分析检索流程，直至没有新得成对NLR基因被检索出来。2.根据权利要求1所述的植物成对NLR抗性基因数据库的构建方法，其特征在于：在步骤(3)中，在通过Hmmscan和NLR
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parser检测完NB
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ARC结构域以及LRR结构域之后，将同时拥有NB
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ARC结构域以及LRR结构域的基因归为主要NLR基因，而只有NB
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ARC结构域的基因则归为候选NLR基因。3.根据权利要求1所述的植物成对NLR抗性基因数据库的构建方法，其特征在于：在步骤(4)中，在检索NLR基因簇的过程中，将同一染色体上物理距离200kb以内或基因编号距离两个及以内的NLR基因视为同一基因簇...

【专利技术属性】
技术研发人员：田大成，秦超，杨四海，张小辉，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：