【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于鉴定tau接种或聚集的基因修饰因子的CRISPR/Cas筛选平台
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2019年3月18日提交的美国申请第62/820,086号的权益，所述美国申请出于所有目的通过引用整体并入本文。
[0003]对通过EFS WEB作为文本文件提交的序列表的引用
[0004]写入文件544635SEQLIST.txt中的序列表为75.7千字节，创建于2020年3月16日，并且通过引用并入本文。
技术介绍
[0005]蛋白质的异常聚集或纤维化是许多疾病的定义性特征，特别是包含若干种神经退行性疾病，如阿尔茨海默病(AD)、帕金森氏病(PD)、额颞叶痴呆(FTD)、肌萎缩侧索硬化(ALS)、慢性创伤脑病(CTE)、克雅氏病(CJD)等。在许多这些疾病中，某些蛋白质原纤维化成不溶性聚集体不仅是疾病的标志，而且还被认为是神经毒性的致病因素。此外，这些疾病的特征是聚集病理学按照刻板模式通过中枢神经系统传播，这一过程与疾病进展相关。因此，鉴定修饰异常蛋白质聚集过程或聚集体细胞间增殖过程的基因和...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种筛选tau聚集基因修饰因子的方法，所述方法包括：(a)提供包括Cas蛋白、连接到第一报告基因的第一tau重复结构域和连接到第二报告基因的第二tau重复结构域的细胞群体；(b)将包括靶向多个基因的多个独特向导RNA的文库引入到所述细胞群体中；(c)培养所述细胞群体以允许基因组编辑和扩增，其中所述多个独特向导RNA与所述Cas蛋白形成复合物，并且所述Cas蛋白切割所述多个基因，从而导致基因功能敲除以产生经基因修饰的细胞群体；(d)使所述经基因修饰的细胞群体与tau接种剂接触以产生经接种的细胞群体；(e)培养所述经接种的细胞群体以允许形成tau聚集体，其中所述第一tau重复结构域和所述第二tau重复结构域的聚集体在所述经接种的细胞群体的子集中形成以产生聚集阳性细胞群体；以及(f)相对于步骤(c)中的所述经基因修饰的细胞群体，测定在步骤(e)中鉴定的所述聚集阳性细胞群体中的所述多个独特向导RNA中的每个独特向导RNA的丰度，其中相对于步骤(c)中的经培养的细胞群体，在步骤(e)中鉴定的所述聚集阳性细胞群体中的向导RNA的富集表明由所述向导RNA靶向的所述基因是tau聚集基因修饰因子，其中由所述向导RNA靶向的所述基因的破坏增强tau聚集。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述Cas蛋白是Cas9蛋白。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述Cas蛋白是酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9。4.根据权利要求3所述的方法，其中所述Cas蛋白包括SEQ ID NO:21，任选地其中所述Cas蛋白由包括SEQ ID NO:22中所示的序列的编码序列编码。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述Cas蛋白、所述连接到所述第一报告基因的第一tau重复结构域和所述连接到所述第二报告基因的第二tau重复结构域在所述细胞群体中稳定地表达。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中对所述Cas蛋白、所述连接到所述第一报告基因的第一tau重复结构域和所述连接到所述第二报告基因的第二tau重复结构域进行编码的核酸在基因组上整合在所述细胞群体中。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中每个向导RNA靶向组成型外显子。8.根据权利要求7所述的方法，其中每个向导RNA靶向5'组成型外显子。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中每个向导RNA靶向第一外显子、第二外显子或第三外显子。10.一种筛选tau聚集基因修饰因子的方法，所述方法包括：(a)提供细胞群体，所述细胞群体包括包含与一个或多个转录激活结构域融合的核酸酶失活Cas蛋白的嵌合Cas蛋白、包含与一个或多个转录激活结构域融合的衔接蛋白的嵌合衔接蛋白、连接到第一报告基因的第一tau重复结构域和连接到第二报告基因的第二tau重复结构域；(b)将包括靶向多个基因的多个独特向导RNA的文库引入到所述细胞群体中；(c)培养所述细胞群体以允许转录激活和扩增，其中所述多个独特向导RNA与所述嵌合Cas蛋白和所述嵌合衔接蛋白形成复合物，并且所述复合物激活所述多个基因的转录，从而
NO:17的残基13
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16相对应的四环，并且所述第二环是与SEQ ID NO:17的残基53
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56相对应的茎环2。21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(c)为约3天到约9天。22.根据权利要求21所述的方法，其中步骤(c)为约6天。23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括在存在从经培养的tau聚集阳性细胞采集的条件培养基的情况下培养所述经基因修饰的细胞群体，其中tau重复结构域以聚集状态稳定地存在。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述条件培养基在处于汇合的tau聚集阳性细胞上持续约1天到约7天之后被采集。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述条件培养基在处于汇合的tau聚集阳性细胞上持续约4天之后被采集。26.根据权利要求23到25中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括在约75％的条件培养基和约25％的新鲜培养基中培养所述经基因修饰的细胞群体。27.根据权利要求23到26中任一项所述的方法，其中所述经基因修饰的细胞群体不与所述tau聚集阳性细胞共培养，其中tau重复结构域以聚集状态稳定地存在。28.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(e)为约2天到约6天。29.根据权利要求28所述的方法，其中步骤(e)为约4天。30.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一报告基因和所述第二报告基因是荧光共振能量转移(FRET)对，并且步骤(e)中的所述聚集阳性细胞群体通过流式细胞术鉴定。31.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过下一代测序测定丰度。32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中如果相对于所述多个独特向导RNA的总群体的向导RNA的丰度在步骤(e)中的所述聚集阳性细胞群体中是步骤(c)中的所述经培养的细胞群体中的至少1.5倍，那么所述向导RNA被视为富集的。33.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤(f)包括在步骤(c)中的第一时间点和/或步骤(c)中的第二时间点处，相对于步骤(c)中的所述经培养的细胞群体，测定在步骤(e)中的所述聚集阳性细胞群体中的所述多个独特向导RNA中的每个独特向导RNA的丰度。34.根据权利要求33所述的方法，其中步骤(c)中的所述第一时间点处于培养所述细胞群体的第一次传代，并且所述第二时间点处于培养所述细胞群体以允许基因组编辑和扩增或转录激活和扩增的中间。35.根据权利要求34所述的方法，其中步骤(c)中的所述第一时间点为培养约三天之后，并且步骤(c)中的所述第二时间点为培养约六天之后。36.根据权利要求33到35中任一项所述的方法，其中如果发生以下情况，则基因被视为tau聚集基因修饰因子，其中所述基因的破坏或转录激活增强tau聚集：(1)在步骤(c)中的所述第一时间点和步骤(c)中的所述第二时间点两者处，相对于所述多个独特向导RNA的总群体的靶向所述基因的向导RNA的丰度在步骤(e)中的所述聚集阳性细胞群体中是步骤(c)中的所述经培养的细胞群体中的至少1.5倍；和/或(2)在步骤(c)中的所述第一时间点或步骤(c)中的所述第二时间点处，相对于所述多
个独特向导RNA的总群体的靶向所述基因的至少两个独特向导RNA的丰度在步骤(e)中的所述聚集阳性细胞群体中是步骤(c)中的所述经培养的细胞群体中的至少1.5倍。37.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在步骤(f)中采取以下步骤来鉴定作为tau聚集基因修饰因子的基因，其中所述基因的破坏或转录激活增强tau聚集：(1)鉴定所述多个独特向导RNA中的哪些独特向导RNA存在于在步骤(e)中产生的所述聚集阳性细胞群体中；(2)使用公式nCn'*(x
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n')C(m
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n)/xCm计算在步骤(f)(1)中鉴定的所述向导RNA存在的随机机会，其中x是在步骤(b)中引入到所述细胞群体中的独特向导RNA的种类，其中m是在步骤(f)(1)中鉴定的独特向导RNA的种类，其中n是在步骤(b)中引入到所述细胞群体中的靶向所述基因的独特向导RNA的种类，并且其中n'是在步骤(f)(1)中鉴定的靶向所述基因的独特向导RNA的种类；(3)计算在步骤(f)(1)中鉴定的所述向导RNA的平均富集得分，其中向导RNA的富集得分是在步骤(e)中产生的所述聚集阳性细胞群体中的所述向导RNA的相对丰度除以步骤(c)中的所述经培养的细胞群体中的所述向导RNA的相对丰度，并且其中相对丰度是所述向导RNA的读段计数除以所述多个独特向导RNA的总群体的读段计数；以及(4)如果靶向所述基因的向导RNA显著低于存在的随机机会并且高于阈值富集得分，那么选择所述基因。38.一种筛选tau聚集基因修饰因子的方法，所述方法包括：(a)提供包括Cas蛋白、连接到第一报告基因的第一tau重复结构域和连接到第二报告基因的第二tau重复结构域的细胞群体；(b)将包括靶向多个基因的多个独特向导RNA的文库引入到所述细胞群体中；(c)培养所述细胞群体以允许基因组编辑和扩增，其中所述多个独特向导RNA与所述Cas蛋白形成复合物，并且所述Cas蛋白切割所述多个基因，从而导致基因功能敲除以产生经基因修饰的细胞群体；(d)使所述经基因修饰的细胞群体与tau接种剂接触以产生经接种的细胞群体；(e)培养所述经接种的细胞群体以允许形成tau聚集体，其中所述第一tau重复结构域和所述第二tau重复结构域的聚集体在所述经接种的细胞群体的第一子集中形成以产生聚集阳性细胞群体，并且不在所述经接种的细胞群体的第二子集中形成以产生聚集阴性细胞群体；以及(f)相对于在步骤(e)中鉴定的所述聚集阴性细胞群体和/或在步骤(d)中的所述经接种的细胞群体，测定在步骤(e)中鉴定的所述聚集阳性细胞群体中的所述多个独特向导RNA中的每个独特向导RNA的丰度，和/或相对于在步骤(e)中鉴定的所述聚集阳性细胞群体和/或在步骤(d)中的所述经接种的细胞群体，测定在步骤(e)中鉴定的所述聚集阴性细胞群体中的所述多个独特向导RNA中的每个独特向导RNA的丰度，其中相对于在步骤(e)中鉴定的所述聚集阳性细胞群体和/或在步骤(d)中的所述经接
种的细胞群体，在步骤(e)中鉴定的所述聚集阴性细胞群体中的向导RNA的富集或其中相对于在步骤(e)中鉴定的所述聚集阴性细胞群体和/或在步骤(d)中的所述经接种的细胞群体，在步骤(e)中鉴定的所述聚集阳性细胞群体中的向导RNA的耗竭表明由所述向导RNA靶向的所述基因是tau聚集基因修饰因子，其中由所述向导RNA靶向的所述基因的破坏防止tau聚集，和/或其中相对于在步骤(e)中鉴定的所述聚集阴性细胞群体和/或在步骤(d)中的所述经接种的细胞群体，在步骤(e)中鉴定的所述聚集阳性细胞群体中的向导RNA的富集或其中相对于在步骤(e)中鉴定的所述聚集阳性细胞群体和/或在步骤(d)中的所述经接种的细胞群体，在步骤(e)中鉴定的所述聚集阴性细胞群体中的向导RNA的耗竭表明由所述向导RNA靶向的所述基因是tau聚集基因修饰因子，其中由所述向导RNA靶向的所述基因的破坏促进或增强tau聚集。39.根据权利要求38所述的方法，其中所述Cas蛋白是Cas9蛋白。40.根据权利要求39所述的方法，其中所述Cas蛋白是酿脓链球菌Cas9。41.根据权利要求40所述的方法，其中所述Cas蛋白包括SEQ ID NO:21，任选地其中所述Cas蛋白由包括SEQ ID NO:22中所示的序列的编码序列编码。42.根据权利要求38到41中任一项所述的方法，其中所述Cas蛋白、所述连接到所述第一报告基因的第一tau重复结构域和所述连接到所述第二报告基因的第二tau重复结构域在所述细胞群体中稳定地表达。43.根据权利要求38到42中任一项所述的方法，其中对所述Cas蛋白、所述连接到所述第一报告基因的第一tau重复结构域和所述连接到所述第二报告基因的第二tau重复结构域进行编码的核酸在基因组上整合在所述细胞群体中。44.根据权利要求38到43中任一项所述的方法，其中每个向导RNA靶向组成型外显子。45.根据权利要求44所述的方法，其中每个向导RNA靶向5'组成型外显子。46.根据权利要求38到45中任一项所述的方法，其中每个向导RNA靶向第一外显子、第二外显子或第三外显子。47.一种筛选tau聚集基因修饰因子的方法，所述方法包括：(a)提供细胞群体，所述细胞群体包括包含与一个或多个转录激活结构域融合的核酸酶失活Cas蛋白的嵌合Cas蛋白、包含与一个或多个转录激活结构域融合的衔接蛋白的嵌合衔接蛋白、连接到第一报告基因的第一tau重复结构域和连接到第二报告基因的第二tau重复结构域；(b)将包括靶向多个基因的多个独特向导RNA的文库引入到所述细胞群体中；(c)培养所述细胞群体以允许转录激活和扩增，其中所述多个独特向导RNA与所述嵌合Cas蛋白和所述嵌合衔接蛋白形成复合物，并且所述复合物激活所述多个基因的转录，从而导致基因表达增加以产生经基因修饰的细胞群体；(d)使所述经基因修饰的细胞群体与tau接种剂接触以产生经接种的细胞群体；(e)培养所述经接种的细胞群体以允许形成tau聚集体，其中所述第一tau重复结构域和所述第二tau重复结构域的聚集体在所述经接种的细胞群体的第一子集中形成以产生聚集阳性细胞群体，并且不在所述经接种的细胞群体的第二子集中形成以产生聚集阴性细胞群体；以及
(f)相对于在步骤(e)中鉴定的所述聚集阴性细胞群体和/或在步骤(d)中的所述经接种的细胞群体，测定在步骤(e)中鉴定的所述聚集阳性细胞群体中的所述多个独特向导RNA中的每个独特向导RNA的丰度，和/或相对于在步骤(e)中鉴定的所述聚集阳性细胞群体和/或在步骤(d)中的所述经接种的细胞群体，测定在步骤(e)中鉴定的所述聚集阴性细胞群体中的所述多个独特向导RNA中的每个独特向导RNA的丰度，其中相对于在步骤(e)中鉴定的所述聚集阳性细胞群体和/或在步骤(d)中的所述经接种的细胞群体，在步骤(e)中鉴定的所述聚集阴性细胞群体中的向导RNA的富集或其中相对于在步骤(e)中鉴定的所述聚集阴性细胞群体和/或在步骤(d)中的所述经接种的细胞群体，在步骤(e)中鉴定的所述聚集阳性细胞群体中的向导RNA的耗竭表明由所述向导RNA靶向的所述基因是tau聚集基因修饰因子，其中由所述向导RNA靶向的所述基因的转录激活防止tau聚集，和/或其中相对于在步骤(e)中鉴定的所述聚集阴性细胞群体和/或在步骤(d)中的所述经接种的细胞群体，在步骤(e)中鉴定的所述聚集阳性细胞群体中的向导RNA的富集或其中相对于在步骤(e)中鉴定的所述聚集阳性细胞群体和/或在步骤(d)中的所述经接种的细胞群体，在步骤(e)中鉴定的所述聚集阴性细胞群体中的向导RNA的耗竭表明由所述向导RNA靶向的所述基因是tau聚集基因修饰因子，其中由所述向导RNA靶向的所述基因的转录激活促进或增强tau聚集。48.根据权利要求47所述的方法，其中所述Cas蛋白是Cas9蛋白。49.根据权利要求48所述的方法，其中所述Cas蛋白是酿脓链球菌Cas9。50.根据权利要求47到49中任一项所述的方法，其中所述嵌合Cas蛋白包括与VP64转录激活结构域融合的所述核酸酶失活Cas蛋白，任选地其中所述嵌合Cas蛋白从N端到C端包括：所述核酸酶失活Cas蛋白；核定位信号；以及所述VP64转录激活结构域。51.根据权利要求47到50中任一项所述的方法，其中所述衔接蛋白是MS2外壳蛋白，并且其中所述嵌合衔接蛋白中的所述一个或多个转录激活结构域包括p65转录激活结构域和HSF1转录激活结构域，任选地其中所述嵌合衔接蛋白从N端到C端包括：所述MS2外壳蛋白；核定位信号；所述p65转录激活结构域；以及所述HSF1转录激活结构域。52.根据权利要求47到51中任一项所述的方法，其中所述嵌合Cas蛋白包括SEQ ID NO:36，任选地其中所述嵌合Cas蛋白由包括SEQ ID NO:38中所示的序列的编码序列编码。53.根据权利要求47到52中任一项所述的方法，其中所述嵌合衔接蛋白包括SEQ ID NO:37，任选地其中所述嵌合衔接蛋白由包括SEQ ID NO:39中所示的序列的编码序列编码。54.根据权利要求47到53中任一项所述的方法，其中所述嵌合Cas蛋白、所述嵌合衔接蛋白、所述连接到所述第一报告基因的第一tau重复结构域和所述连接到所述第二报告基因的第二tau重复结构域在所述细胞群体中稳定地表达。55.根据权利要求47到54中任一项所述的方法，其中对所述嵌合Cas蛋白、所述嵌合衔接蛋白、所述连接到所述第一报告基因的第一tau重复结构域和所述连接到所述第二报告基因的第二tau重复结构域进行编码的核酸在基因组上整合在所述细胞群体中。56.根据权利要求47到55中任一项所述的方法，其中每个向导RNA靶向转录起始位点上游200bp内的向导RNA靶序列。57.根据权利要求47到56中任一项所述的方法，其中每个向导RNA包括所述嵌合衔接蛋
白可特异性结合的一个或多个衔接结合元件，任选地其中每个向导RNA包括所述嵌合衔接蛋白可特异性结合的两个衔接结合元件，任选地其中第一衔接结合元件处于所述一个或多个向导RNA中的每个向导RNA的第一环内，并且第二衔接结合元件处于所述一个或多个向导RNA中的每个向导RNA的第二环内，任选地其中所述衔接结合元件包括SEQ ID NO:33中所示的序列，并且任选地其中一个或多个向导RNA中的每个向导RNA是包括与反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)部分融合的CRISPR RNA(crRNA)部分的单向导RNA，并且所述第一环是与SEQ ID NO:17的残基13
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16相对应的四环，并且所述第二环是与SEQ ID NO:17的残基53
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56相对应的茎环2。58.根据权利要求38到57中任一项所述的方法，其中步骤(c)为约3天到约13天。59.根据权利要求58所述的方法，其中步骤(c)为约7天到约10天，为约7天或为约10天。60.根据权利要求38到59中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括在存在包括来自经培养的tau聚集阳性细胞的细胞裂解物的培养基的情况下培养所述经基因修饰的细胞群体，其中tau重复结构域以聚集状态稳定地存在。61.根据权利要求60所述的方法，其中所述培养基中的所述细胞裂解物的浓度为约1到约5μg/mL。62.根据权利要求60或61所述的方法，其中包括所述细胞裂解物的所述培养基进一步包括脂质体或另一种转染试剂。63.根据权利要求62所述的方法，其中包括所述细胞裂解物的所述培养基包括浓度为约1.5到约4μL/mL的脂质体。64.根据权利要求60到63中任一项所述的方法，其中所述经基因修饰的细胞群体不与所述tau聚集阳性细胞共培养，其中tau重复结构域以聚集状态稳定地存在。65.根据权利要求38到64中任一项所述的方法，其中步骤(e)为约1天到约3天。66.根据权利要求65所述的方法，其中步骤(e)为约2天。67.根据权利要求38到66中任一项所述的方法，其中所述第一报告基因和所述第二报告基因是荧光共振能量转移(FRET)对，并且步骤(e)中的所述聚集阳性细胞群体和所述聚集阴性细胞群体通过流式细胞术鉴定。68.根据权利要求38到67中任一项所述的方法，其中通过下一代测序测定丰度。69.根据权利要求38到68中任一项所述的方法，其中如果相对于所述多个独特向导RNA的总群体的向导RNA的丰度在步骤(e)中的所述聚集阴性细胞群体中是步骤(e)中的所述聚集阳性细胞群体和/或步骤(d)中的所述经接种的细胞群体中的至少1.5倍，那么所述向导RNA被视为在步骤(e)中的所述聚集阴性细胞群体中是富集的，并且其中如果相对于所述多个独特向导RNA的总群体的向导RNA的丰度在步骤(e)中的所述聚集阳性细胞群体中是步骤(e)中的所述聚集阴性细胞群体和/或步骤(d)中的所述经接种的细胞群体中的至少1/1.5，那么所述向导RNA被视为在步骤(e)中的所述聚集阳性细胞群体中是耗竭的，或者如果相对于所述多个独特向导RNA的总群体的向导RNA的丰度在步骤(e)中的所述聚集阳性细胞群体中是步骤(e)中的所述聚集阴性细胞群体和/或步骤(d)中的所述经接种的细胞群体中的至少1.5倍，那么所述向导RNA被视为在步骤(e)中的所述聚集阳性细胞群体中是富集的，并且其中如果相对于所述多个独特向导RNA的总群体的向导RNA的丰度在步骤
(e)中的所述聚集阴性细胞群体中是步骤(e)中的所述聚集阳性细胞群体和/或步骤(d)中的所述经接种的细胞群体中的至少1/1.5，那么所述向导RNA被视为在步骤(e)中的所述聚集阴性细胞群体中是耗竭的。70.根据权利要求38到69中任一项所述的方法，其中步骤(f)包括相对于步骤(e)中的所述聚集阳性细胞群体、第一时间点处步骤(c)中的所述经培养的细胞群体和第二时间点处步骤(d)中的所述经接种的细胞群体，测定步骤(e)中的所述聚集阴性细胞群体中的所述多个独特向导RNA中的每个独特向导RNA的丰度，和/或其中步骤(f)包括相对于步骤(e)中的所述聚集阴性细胞群体、第一时间点处步骤(c)中的所述经培养的细胞群体和第二时间点处步骤(d)中的所述经接种的细胞群体，测定步骤(e)中的所述聚集阳性细胞群体中的所述多个独特向导RNA中的每个独特向导RNA的丰度。71.根据权利要求70所述的方法，其中步骤(c)中的所述第一时间点处于培养所述细胞群体的第一次传代。72.根据权利要求71所述的方法，其中步骤(c)中的所述第一时间点为培养约3天之后，并且步骤(c)中的所述第二时间点为培养约7天或培养约10天之后。73.根据权利要求70到72中任一项所述的方法，其中：(I)如果发生以下情况，则基因被视为tau聚集基因修饰因子，其中所述基因的破坏或转录激活防止tau聚集：(1)相对于所述多个独特向导RNA的总群体的靶向所述基因的向导RNA的丰度在步骤(e)中的所述聚集阴性细胞群体中是步骤(e)中的所述聚集阳性细胞群体、所述第一时间点处步骤(c)中的所述经培养的细胞群体和所述第二时间点处步骤(d)中的所述经接种的细胞群体中的至少1.5倍；和/或(2)相对于所述多个独特向导RNA的总群体的靶向所述基因的向导RNA的丰度在步骤(e)中的所述聚集阴性细胞群体中是步骤(e)中的所述聚集阳性细胞群体和所述第二时间点处步骤(d)中的所述经接种的细胞群体中的至少1.5倍；和/或(3)相对于所述多个独特向导RNA的总群体的靶向所述基因的向导RNA的丰度在步骤(e)中的所述聚集阳性细胞群体中是步骤(e)中的所述聚集阴性细胞群体、所述第一时间点处步骤(c)中的所述经培养的细胞群体和所述第二时间点处步骤(d)中的所述经接种的细胞群体中的至少1/1.5；和/或(4)相对于所述多个独特向导RNA的总群体的靶向所述基因的向导RNA的丰度在步骤(e)中的所述聚集阳性细胞群体中是步骤(e)中的所述聚集阴性细胞群体和所述第二时间点处步骤(d)中的所述经接种的细胞群体中的至少1/1.5；或者(II)如果发生以下情况，则基因被视为tau聚集基因修饰因子，其中所述基因的破坏或转录激活促进或增强tau聚集：(1)相对于所述多个独特向导RNA的总群体的靶向所述基因的向导RNA的丰度在步骤(e)中的所述聚集阳性细胞群体中是步骤(e)中的所述聚集阴性细胞群体、所述第一时间点处步骤(c)中的所述经培养的细胞群体和所述第二时间点处步骤(d)中的所述经接种的细胞群体中的至少1.5倍；和/或(2)相对于所述多个独特向导RNA的总群体的靶向所述基因的向导RNA的丰度在步骤(e)中的所述聚集阳性细胞群体中是步骤(e)中的所述聚集阴性细胞群体和所述第二时间
点处步骤(d)中的所述经接种的细胞群体中的至少1.5倍；和/或(3)相对于所述多个独特向导RNA的总群体的靶向所述基因的向导RNA的丰度在步骤(e)中的所述聚集阴性细胞群体中是步骤(e)中的所述聚集阳性细胞群体、所述第一时间点处步骤(c)中的所述经培养的细胞群体和所述第二时间点处步骤(d)中的所述经接种的细胞群体中的至少1/1.5；和/或(4)相对于所述多个独特向导RNA的总群体的靶向所述基因的向导RNA的丰度在步骤(e)中的所述聚集阴性细胞群体中是步骤(e)中的所述聚集阳性细胞群体和所述第二时间点处步骤(d)中的所述经接种的细胞群体中的至少1/1.5。74.根据权利要求38到73中任一项所述的方法，其中：(I)在步骤(f)中采取以下步骤来鉴定作为tau聚集基因修饰因子的基因，其中所述基因的破坏或转录激活防止tau聚集：(1)鉴定所述多个独特向导RNA中的哪些独特向导RNA存在于在步骤(e)中产生的所述聚集阴性细胞群体中；(2)使用公式nCn'*(x
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n')C(m
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n)/xCm计算在步骤(f)(1)中鉴定的所述向导RNA存在的随机机会，其中x是在步骤(b)中引入到所述细胞群体中的独特向导RNA的种类，其中m是在步骤(f)(1)中鉴定的独特向导RNA的种类，其中n是在步骤(b)中引入到所述细胞群体中的靶向所述基因的独特向导RNA的种类，并且其中n'是在步骤(f)(1)中鉴定的靶向所述基因的独特向导RNA的种类；(3)计算在步骤(f)(1)中鉴定的所述向导RNA的平均富集得分，其中向导RNA的富集得分是在步骤(e)中产生的所述聚集阴性细胞群体中的所述向导RNA的相对丰度除以在步骤(e)中产生的所述聚集阳性细胞群体中的或步骤(d)中的所述经接种的细胞群体中的所述向导RNA的相对丰度，并且其中相对丰度是所述向导RNA的读段计数除以所述多个独特向导RNA的总群体的读段计数；以及(4)如果靶向所述基因的向导RNA显著低于存在的随机机会并且高于阈值富集得分，那么选择所述基因；或者(II)在步骤(f)中采取以下步骤来鉴定作为tau聚集基因修饰因子的基因，其中所述基因的破坏或转录激活促进或增强tau聚集：(1)鉴定所述多个独特向导RNA中的哪些独特向导RNA存在于在步骤(e)中产生的所述聚集阳性细胞群体中；(2)使用公式nCn'*(x
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n')C(m
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n)/xCm计算在步骤(f)(1)中鉴定的所述向导RNA存在的随机机会，其中x是在步骤(b)中引入到所述细胞群体中的独特向导RNA的种类，其中m是在步骤(f)(1)中鉴定的独特向导RNA的种类，其中n是在步骤(b)中引入到所述细胞群体中的靶向所述基因的独特向导RNA的种类，并且其中n'是在步骤(f)(1)中鉴定的靶向所述基因的独特向导RNA的种类；
(3)计算在步骤(f)(1)中鉴定的所述向导RNA的平均富集得分，其中向导RNA的富集得分是在步骤(e)中产生的所述聚集阳性细胞群体中的所述向导RNA的相对丰度除以在步骤(e)中产生的所述聚集阴性细胞群体中的或步骤(d)中的所述经接种的细胞群体中的所述向导RNA的相对丰度，并且其中相对丰度是所述向导RNA的读段计数除以所述多个独特向导RNA的总群体的读段计数；以及(4)如果靶向所述基因的向导RNA显著低于存在的随机机会并且高于阈值富集得分，那么选择所述基因。75.一种筛选tau聚集和/或解聚基因修饰因子的方法，所述方法包括：(a)提供包括Cas蛋白、连接到第一报告基因的第一tau重复结构域和连接到第二报告基因的第二tau重复结构域的细胞群体，其中所述细胞是tau聚集阳性细胞，其中tau重复结构域以聚集状态稳定地存在；(b)将包括靶向多个基因的多个独特向导RNA的文库引入到所述细胞群体中；(c)培养所述细胞群体以允许基因组编辑和扩增，其中所述多个独特向导RNA与所述Cas蛋白形成复合物，并且所述Cas蛋白切割所述多个基因，从而导致基因功能敲除以产生经基因修饰的细胞群体，并且其中所述培养产生聚集阳性细胞群体和聚集阴性细胞群体；(d)鉴定所述聚集阳性细胞群体和所述聚集阴性细胞群体；以及(e)相对于在步骤(d)中鉴定的所述聚集阴性细胞群体和/或步骤(c)中一个或多个时间点处的经培养的细胞群体，测定在步骤(d)中鉴定的所述聚集阳性细胞群体中的所述多个独特向导RNA中的每个独特向导RNA的丰度，和/或相对于在步骤(d)中鉴定的所述聚集阳性细胞群体和/或步骤(c)中一个或多个时间点处的所述经培养的细胞群体，测定在步骤(d)中鉴定的所述聚集阴性细胞群体中的所述多个独特向导RNA中的每个独特向导RNA的丰度，其中相对于在步骤(d)中鉴定的所述聚集阳性细胞群体和/或步骤(c)中一个或多个时间点处的所述经培养的细胞群体，在步骤(d)中鉴定的所述聚集阴性细胞群体中的向导RNA的富集或其中相对于在步骤(d)中鉴定的所述聚集阴性细胞群体和/或步骤(c)中一个或多个时间点处的所述经培养的细胞群体，在步骤(d)中鉴定的所述聚集阳性细胞群体中的向导RNA的耗竭表明由所述向导RNA靶向的所述基因是tau解聚基因修饰因子，其中由所述向导RNA靶向的所述基因的破坏促进tau解聚，和/或其中相对于在步骤(d)中鉴定的所述聚集阴性细胞群体和/或步骤(c)中一个或多个时间点处的所述经培养的细胞群体，在步骤(d)中鉴定的所述聚集阳性细胞群体中的向导RNA的富集或其中相对于在步骤(d)中鉴定的所述聚集阳性细胞群体和/或步骤(c)中一个或多个时间点处的所述经培养的细胞群体，在步骤(d)中鉴定的所述聚集阴性细胞群体中的向导RNA的耗竭表明由所述向导RNA靶向的所述基因是tau聚集基因修饰因子，其中由所述向导RNA靶向的所述基因的破坏促进或增强tau聚集。76.根据权利要求75所述的方法，其中所述Cas蛋白是Cas9蛋白。77.根据权利要求76所述的方法，其中所述Cas蛋白是酿脓链球菌Cas9。78.根据权利要求77所述的方法，其中所述Cas蛋白包括SEQ ID NO:21，任选地其中所述Cas蛋白由包括SEQ ID NO:22中所示的序列的编码序列编码。
79.根据权利要求75到78中任一项所述的方法，其中所述Cas蛋白、所述连接到所述第一报告基因的第一tau重复结构域和所述连接到所述第二报告基因的第二tau重复结构域在所述细胞群体中稳定地表达。80.根据权利要求75到79中任一项所述的方法，其中对所述Cas蛋白、所述连接到所述第一报告基因的第一tau重复结构域和所述连接到所述第二报告基因的第二tau重复结构域进行编码的核酸在基因组上整合在所述细胞群体中。81.根据权利要求75到80中任一项所述的方法，其中每个向导RNA靶向组成型外显子。...
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