一种染色方法、试剂盒及应用技术

本发明专利技术涉及一种染色方法、试剂盒及应用。本发明专利技术通过在P16

【技术实现步骤摘要】
一种染色方法、试剂盒及应用


[0001]本专利技术属于细胞学染色
，具体涉及一种染色方法、试剂盒及应用。

技术介绍

[0002]宫颈癌是影响全球女性健康的第四大恶性肿瘤，也是我国第二大女性恶性肿瘤。当前宫颈癌的筛查流程是“宫颈脱落细胞检查
‑
阴道镜检查
‑
活检病理检查”三阶梯的筛查方式，活检病理是诊断的“金标准”。液基薄层细胞学检查(TCT)是早期筛查宫颈癌的有效手段，易受取材、染色及病理医师主观判断的影响，存在一定的假阴性率或漏诊率，诊断准确性欠佳。HPV病毒检测作为一种辅助检测手段，虽然敏感性高，但特异性低，同时还存在着阴道镜转诊率高的弊端。P16
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抑癌基因蛋白表达作为早期宫颈癌的生物标志物，具有较高的特异性和灵敏度，在宫颈组织活检样本中，已经得到普遍认可与应用。
[0003]2012年，美国病理学会(CAP)、美国阴道镜与宫颈病理学会(ASCCP)、美国临床病理学会(ASCP)对宫颈癌筛查的联合指南建议，特定的P16
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蛋白表达是高危型HPV感染是否影响细胞周期调控的替代生物标志物。2014版TBS(The Bethesda System)指出：P16
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免疫细胞化学染色技术可以辅助细胞学诊断。2017年我国《子宫颈癌综合防控指南》和2014年第4版WHO《女性生殖器官肿瘤分类》推荐使用P16
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作为辅助LSIL和HSIL诊断的分子生物学指标，提高宫颈癌诊断的准确性。
[0004]P16
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基因为多肿瘤抑制基因，其表达的蛋白可直接参与调控细胞周期，通过抑制细胞增殖和分裂达到抑癌作用。正常细胞周期中表达的P16
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表现为抗增殖效应，因此在终末分化的上皮细胞中，正常水平下不能用免疫组化方法检测到。但在HPV相关的癌前病变和癌变中，代表确立的维持恶性表型的必要因素E7癌蛋白整合到宿主基因内，结合Rb蛋白使其失活，细胞持续增殖聚集形成肿瘤，相应P16
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出现了强烈的过度表达而被检测到。因此P16
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被认为是HPV感染转化的一个替代性标志物，将P16
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免疫标记应用于液基细胞学，可利用抗原抗体特异性结合的原理，在液基细胞学中提供特异性的染色技术，同时联合TCT细胞形态学结果作出精准判断。
[0005]然而目前在宫颈癌大规模筛查工作中，液基细胞学通常采用巴氏染色后诊断，有时常需要进一步做免疫细胞化学染色以满足鉴别诊断。但由于再次取材受限，又难以重新获得标本制片，用细胞学剩余标本重新制成的细胞涂片又没有原涂片中的可疑细胞，因此如何在原涂片上进行免疫细胞化学染色成为关键。
[0006]P16
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是HSIL的检测特异性指标，敏感性与HPV相当，特异性可与细胞学相媲美，并可减少阴道镜转诊率。CN109425527A提供了一种细胞染色方法，能够同时提供细胞形态学和癌症标志物E7癌蛋白的表达鉴定，具体染色步骤为：采用液基细胞仪进行制片并固定后得到待染色涂片；采用抗肿瘤标志蛋白HPV E7抗体进行第一次免疫细胞化学染色；采用巴氏染色液进行第二次染色。但该方法仍然存在以下缺陷：
①
采用液基细胞仪进行制片后于95％乙醇中固定20～60min，风干20min以上，才得到待染色的涂片，固定时间过长；
②
细胞涂片采用常规高温修复的方式，耗时40
‑
60min、加热及降温时间长且需要加热设备，过程
繁琐；
③
没有解决血性样本免疫细胞化学染色时的背景和非特异性着色问题；
④
采用HPV
‑
E7蛋白对细胞涂片进行免疫细胞化学染色；
⑤
在HPV
‑
E7第一次染色后，中性树胶封片后再次经过褪片脱胶处理后才进行巴氏染色，操作流程繁琐。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种染色方法，能够实现在同一张细胞片子上进行P16
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免疫细胞化学染色后原位进行巴氏染色。
[0008]本专利技术的第二个目的在于提供一种辅助宫颈鳞状上皮细胞染色的试剂盒。
[0009]本专利技术的第三个目的在于提供一种宫颈鳞状上皮细胞染色试剂盒。
[0010]本专利技术的第四个目的在于提供上述试剂盒的应用。
[0011]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0012]一种染色方法，包括如下步骤：
[0013]1)液基薄层细胞制片：使用液基薄层细胞制片方法制备细胞涂片；
[0014]2)固定：清洗液冲洗细胞涂片，在样本区域滴加固定剂室温固定；所述固定剂由95％乙醇、冰醋酸、丙酮组成，其中，95％乙醇、冰醋酸、丙酮的体积比0.9：0.1：(0.01
‑
0.03)；
[0015]3)细胞通透：清洗液冲洗细胞涂片，采用通透剂处理细胞涂片；所述通透剂为通透剂Ⅰ和通透剂Ⅱ两种试剂，所述通透剂Ⅰ为0.25％
‑
0.5％胰酶溶液；所述通透剂Ⅱ为0.2
‑
0.4％胃酶溶液；
[0016]4)免疫细胞化学染色：采用P16
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抗体对通透处理后的细胞涂片进行免疫细胞化学染色；
[0017]5)巴氏染色：对步骤4)已经完成免疫细胞化学染色的细胞先采用橘黄G染色液染色，漂洗后采用EA50染色液染色；
[0018]6)脱水、透明、封片。
[0019]固定剂的主要作用为固定细胞结构，维持细胞DNA和蛋白质完整性。一个良好的固定剂不但本身不能损害抗原性，还应很好地保持组织、细胞的结构以及允许大分子进入细胞内与抗原结合。以醛类为基础的固定液(如甲醛)处理标本，能与组织细胞内蛋白质的许多功能基结合，在相邻蛋白质之间形成稳定的桥键，有些交联发生在特殊抗原的抗体反应位置，抗原抗体结合可被干扰或阻断，免疫组化染色时需要进行抗原修复，故免疫细胞化学染色一般不宜选用甲醛固定。
[0020]本专利技术染色方法中采用的固定剂由95％乙醇、冰醋酸、丙酮组成。研究显示，无交联作用的醇类固定剂在保存DNA方面比醛类固定剂效果更好。而单纯用醇类固定剂，虽然能够固定流动性强的蛋白，但也会不同程度上造成细胞收缩，易导致核固缩、细胞空泡出现等缺陷，从而影响细胞判读。本专利技术中固定剂的主要成分为95％乙醇，其作为蛋白质沉淀剂能较好地保存抗原。冰醋酸作为核酸凝结剂起到辅助固定的作用，一方面能够使收缩的细胞扩张，对醇类效果进行中和；另一方面，还能够有效溶解细胞制片中的黏液，在此基础上配合后续的通透剂处理，发挥二者的协同作用，能够很好打破封闭的抗原决定簇的蛋白分子与化学键的交联，免疫组化效果大大优于甲醛固定剂。丙酮固定作用较为缓和，能更好地保存细胞上的抗原，尤其有利于提升免疫细胞化学核染色本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种染色方法，其特征在于，包括如下步骤：1)液基薄层细胞制片：使用液基薄层细胞制片方法制备细胞涂片；2)固定：清洗液冲洗细胞涂片，在样本区域滴加固定剂室温固定；所述固定剂由95％乙醇、冰醋酸、丙酮组成，其中，95％乙醇、冰醋酸、丙酮的体积比0.9：0.1：(0.01
‑
0.03)；3)细胞通透：清洗液冲洗细胞涂片，采用通透剂处理细胞涂片；所述通透剂为通透剂Ⅰ和通透剂Ⅱ两种试剂，所述通透剂Ⅰ为0.25％
‑
0.5％胰酶溶液；所述通透剂Ⅱ为0.2％
‑
0.4％胃酶溶液；4)免疫细胞化学染色：对通透处理后的细胞涂片进行免疫细胞化学染色；5)巴氏染色：对步骤4)已经完成免疫细胞化学染色的细胞涂片先采用橘黄G染色液染色，漂洗后采用EA50染色液染色；6)脱水、透明、封片。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中采用宫颈脱落细胞样本进行液基薄层细胞制片。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，固定的时间为5min。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中采用通透剂处理细胞涂片包括如下步骤：先在样本区域滴加通透剂Ⅰ并孵育，清洗液冲洗，再在样本区域滴加通透剂Ⅱ并孵育，或先在样本区域滴加通透剂Ⅱ并孵育，清洗液冲洗，再在样本区域滴加通透剂Ⅰ并孵育。5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)中免疫细胞化学染色包括如下步骤：
①
加过氧化物酶封闭剂：清洗液冲洗细胞涂片，在样本区域滴加内源性过氧化物酶封闭剂，室温下孵育5min；
②
一抗孵育：清洗液冲洗细胞涂片，在样本区域滴加P16
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抗体，于37℃孵育60min；
③
一抗后孵育：清洗液冲洗细胞涂片，在样本区域滴加一抗后试剂Linker，于37℃孵育20min；
④
二抗孵育：清洗液冲洗细胞涂片，在样本区域滴加酶标二抗聚合物试剂，于37℃孵育30min；
⑤
...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢雅南，牛银银，米贯勋，赵琳琳，张琳姿，李三华，刘文弟，齐华，刘畅，
申请(专利权)人：河南赛诺特生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：