一种甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆构建及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆载体及其构建方法和鉴定方法，所述甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆载体命名为土壤杆菌Agrobacterium sp.，于2021年5月31日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCC No.22647。本发明专利技术将SCSMV全长cDNA序列分为A、B和C 3个重叠片段和pGreenII

【技术实现步骤摘要】
一种甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆构建及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆构建及其应用。

技术介绍

[0002]病毒侵染性克隆是病毒反向遗传学研究的基础和前提。对于植物RNA病毒来说，侵染性克隆是具有完整生物活性的cDNA或者从cDNA克隆获得的具有侵染力的体外转录RNA产物。雀麦花叶病毒是第一个被成功构建出侵染性克隆的植物RNA病毒，随后大量的RNA病毒的侵染性克隆被成功构建，植物RNA病毒的研究获得了快速发展。
[0003]获得植物RNA病毒侵染性克隆，可以对cDNA克隆进行点突变，缺失突变或插入突变，可以研究病毒的基因编码策略，研究其编码的基因功能，研究基因组上非编码序列对病毒基因组RNA复制和转录的调控等。植物RNA病毒cDNA克隆可以作为基因表达载体，开发植物生物反应器。cDNA克隆还可以用于病毒诱导的基因沉默研究(VIGS)，VIGS目前被广泛应用于植物基因功能研究，对植物反向遗传学研究具有很大的帮助。
[0004]甘蔗条纹花叶病毒(SCSMV)自1978年首次在美国引自巴基斯坦的甘蔗种质中检测到，在全球范围内迅速传播，目前已在印度、泰国、印度尼西亚等国家广泛发生，对当地甘蔗产业造成严重影响。SCSMV侵染导致甘蔗叶色失绿，叶片出现黄绿相间不规则的嵌纹、条斑或斑驳，甘蔗茎径变小，每丛茎数减少，从而使得蔗茎产量下降，进而影响蔗糖产量(图1)。据估计，当SCSMV发生率超过50％时，可导致蔗糖产量减少20％左右。
[0005]然而由于缺乏效果显著的化学药品进行防控，目前甘蔗生产上主要是通过栽培脱毒健康种苗对甘蔗病毒病进行防控。而脱毒种苗种植于大田之后，很容易重新感染病毒病而失去防控效果。因此通过构建SCSMV全长cDNA侵染性克隆对SCSMV与甘蔗之间的互作机制及致病机理进行深入的研究，有可能为开发新的SCSMV科学防控技术提供理论依据。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，是提供一种甘蔗条纹花叶病毒(SCSMV)全长cDNA侵染性克隆载体及其构建方法和接种鉴定方法。
[0007]本专利技术的第一个方面是提供一种甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆载体，命名为土壤杆菌Agrobacterium sp.，于2021年5月31日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCC No.22647。
[0008]本专利技术的第二个方面是提供一种如本专利技术第一个方面所述的甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆载体的构建方法，包括以下步骤：
[0009](1)从感染单一甘蔗条纹花叶病毒的蔗植株叶片中提取植物总RNA；
[0010](2)利用提取的植物总RNA获得甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA序列：
[0011](3)以获得的序列为基础，并结合表达载体pGreenII
‑
35S序列，分别设计甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA序列的A片段、B片段和C片段三个重叠片段以及pGreenII
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35S载体D片段
的4对引物，分别对A片段、B片段、C片段和D片段进行扩增，其中，A片段的序列为SEQ ID NO.1所述序列的第2388bp至第5583bp，B片段的序列为SEQ ID NO.1所述序列的第5564bp至第8982bp，C片段的序列为SEQ ID NO.1所述序列的第8755bp至第12226bp，D片段的序列如SEQ ID NO.18所示，A片段的引物对的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，B片段的引物对的序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，C片段的引物对的序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示，D片段的引物对的序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；
[0012](4)将扩增获得的A片段、B片段、C片段和D片段经Gibson技术拼接重组后直接转化GV3101(pSoup)农杆菌感受态，挑单克隆进行测序鉴定，测序鉴定正确的克隆载体即为成功构建的甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆载体。
[0013]优选地，步骤(2)具体为：
[0014]根据已有的SCSMV全长参考序列设计PCR扩增引物，将SCSMV全长基因组分为片段1、片段2、片段3三个重叠大片段分别进行克隆测定，并且通过5'RACE和3'RACE技术，对5'端和3'端的序列进行测序确认，测序结果经拼接，获得完整的SCSMV全长cDNA序列信息。
[0015]其中，片段1的序列为SEQ ID NO.1所述序列的第2413bp至第5650bp，片段2的序列为SEQ ID NO.1所述序列的第5495bp至第9063bp，片段3的序列为SEQ ID NO.1所述序列的第8755bp至第12193bp，片段1的引物对的序列如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示，片段2的引物对的序列如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示，片段3的引物对的序列如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示。
[0016]本专利技术的第三个方面是提供一种如本专利技术第一个方面所述的甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆载体的鉴定方法，将所述克隆载体进行活化培养后，接种至无毒甘蔗单芽茎节，将单芽茎节种植，长出小苗后剪取幼嫩叶片组织提取总RNA，用甘蔗条纹花叶病毒的特异检测引物F:ACAAGGAACGCAGCCACCT和R:ACTAAGCGGTCAGGCAAC进行RT
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PCR检测，与经鉴定确认感染SCSMV病毒的阳性植株检测结果一致，说明获得了具备侵染活性的甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆载体。
[0017]本专利技术的第四个方面是提供一种引物对，其为如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的引物对，在构建本专利技术第一个方面甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆载体时，用于扩增A片段。
[0018]本专利技术的第五个方面是提供一种引物对，其为如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的引物对，在构建本专利技术第一个方面甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆载体时，用于扩增B片段。
[0019]本专利技术的第六个方面是提供一种引物对，其为如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示的引物对，在构建本专利技术第一个方面甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆载体时，用于扩增C片段。
[0020]本专利技术的第七个方面是提供一种引物对，其为如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示的引物对，在构建本专利技术第一个方面甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆载体时，用于扩增D片段。
[0021]本专利技术的第八个方面是提供一种引物对，其组成为：F:ACAAGGAACGCAGCCACCT和R:ACTAAGCGGTCAGGCAAC。
[0022]本专利技术的第九个方面是提供如本专利技术第四个方本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆载体，其特征在于，命名为土壤杆菌Agrobacterium sp.，于2021年5月31日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCC No.22647。2.一种如权利要求1所述的甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)从感染单一甘蔗条纹花叶病毒的蔗植株叶片中提取植物总RNA；(2)利用提取的植物总RNA获得甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA序列：(3)以获得的序列为基础，并结合表达载体pGreenII
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35S序列，分别设计甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA序列的A片段、B片段和C片段三个重叠片段以及pGreenII
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35S载体D片段的4对引物，对A片段、B片段、C片段和D片段进行扩增，其中，A片段的序列为SEQ ID NO.1所述序列的第2388bp至第5583bp，B片段的序列为SEQ ID NO.1所述序列的第5564bp至第8982bp，C片段的序列为SEQ ID NO.1所述序列的第8755bp至第12226bp，D片段的序列如SEQ ID NO.18所示，A片段的引物对的序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，B片段的引物对的序列如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，C片段的引物对的序列如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示，D片段的引物对的序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；(4)将扩增获得的A片段、B片段、C片段和D片段经Gibson技术拼接重组后直接转化GV3101(pSoup)农杆菌感受态，挑单克隆进行测序鉴定，测序鉴定正确的克隆载体即为成功构建的甘蔗条纹花叶病毒全长cDNA侵染性克隆载体。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)具体为：根据已有的SCSMV全长参考序列设计PCR扩增引物，将SCSMV全长基因组分为片段1、片段2、片段3三个重叠大片段分别进行克隆测定，并且通过5'RACE和3'RACE技术，对5'端和...

【专利技术属性】
技术研发人员：王文治，沈林波，张树珍，王俊刚，冯小艳，冯翠莲，赵婷婷，
申请(专利权)人：中国热带农业科学院热带生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：