传染性胰脏坏死病疫苗及其病毒在大鳞大麻哈鱼胚胎细胞上扩增的方法技术

本发明专利技术公开了传染性胰脏坏死病疫苗及其病毒在大鳞大麻哈鱼胚胎细胞上扩增的方法。本发明专利技术提供的体外增殖传染性胰脏坏死病毒的方法，包括如下步骤：将传染性胰脏坏死病毒按照剂量100～10000TCID

【技术实现步骤摘要】
传染性胰脏坏死病疫苗及其病毒在大鳞大麻哈鱼胚胎细胞上扩增的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其是涉及传染性胰脏坏死病疫苗及其病毒在大鳞大麻哈鱼胚胎细胞上扩增的方法。

技术介绍

[0002]传染性胰脏坏死病毒(Infectious pancreatic necrosis virus，IPNV)属于水生双RNA病毒科Birnavirdate，水生双RNA病毒属Aquabirnavirus，是传染性胰脏坏死病(Infectious pancreatic necrosis，IPN)的病原。IPN于上世纪50代在美国开始流行，至今已传播到法国、土耳其、智利、墨西哥、芬兰、挪威、西班牙、日本、韩国、伊朗。我国最早于上世纪80年代暴发IPN疫情，造成了巨大的经济损失，成为制约我国鲑鳟鱼产业发展的重要疫病之一。
[0003]疫苗免疫是当前防控IPN最有效的方法，由于灭活疫苗具有操作简单、免疫效果好、安全性高以及生产成本低等优势成为防控病毒性疾病的首选。病毒的高效扩增是灭活疫苗制备的基础，其效果受到接毒剂量的影响，当以高剂量进行接毒时，会产生大量缺陷病毒，这些缺陷病毒不能正常复制，导致病毒无法正常传代，从而影响疫苗的生产。当接种剂量过小时，病毒的繁殖速度会显著下降，延长病毒繁殖所需的时间。目前，并无关于IPNV体外增殖方案的研究报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术一个目的是提供一种体外增殖传染性胰脏坏死病毒的方法。
[0005]本专利技术提供的一种体外增殖传染性胰脏坏死病毒的方法，包括如下步骤：将传染性胰脏坏死病毒按照剂量100～10000 TCID
50
接种于8.0
×
105个大鳞大麻哈鱼胚胎细胞，培养，实现体外增殖传染性胰脏坏死病毒。
[0006]可选地，上述方法中，所述培养的时间为48～84小时。
[0007]可选地，上述方法中，所述培养的温度为15℃。
[0008]可选地，上述方法中，所述培养的时间为72小时、所述培养的温度为15℃，所述接种的剂量为100 TCID
50
。
[0009]本专利技术另一个目的是提供一种制备传染性胰脏坏死病疫苗的方法。
[0010]本专利技术提供了一种制备传染性胰脏坏死病疫苗的方法，包括如下步骤：
[0011]1)将传染性胰脏坏死病毒按照剂量100～10000 TCID
50
接种于8.0
×
105个大鳞大麻哈鱼胚胎细胞，培养，收集上清液，得到体外增殖的传染性胰脏坏死病毒；
[0012]2)用所述体外增殖的传染性胰脏坏死病毒制备传染性胰脏坏死病疫苗。
[0013]可选地，上述方法中，所述培养的时间为48～84小时。
[0014]可选地，上述方法中，所述培养的温度为15℃。
[0015]可选地，上述方法中，所述培养的时间为72小时、所述培养的温度为15℃，所述剂
immune responses against infectious hematopoietic necrosis virus and infectious pancreaticnecrosis virus in rainbow trout[J].Scientific reports，2017,7(1)：5700.。
[0032]IPNV毒株由本实验室分离并保存，该毒株记载在如下文献中：Duan K Y，Zhao J Z，Ren G M，et al.Molecular Evolution of Infectious Pancreatic Necrosis Virus in China[J].Viruses，2021，13(3)：488.。
[0033]实施例1、IPNV病毒液的制备
[0034]一、CHSE
‑
214细胞的复苏和培养
[0035]从液氮罐中取出冻存的CHSE
‑
214细胞，迅速放入30℃恒温水浴锅中，待其融化，在无菌条件下移入15m1离心管，1000g/min离心2min弃去细胞冻存液，加入1mlM199细胞培养液(含10％胎牛血清和1％双抗)混匀。将吹匀的细胞移入T
‑
25细胞培养瓶，并补加4ml细胞培养液，吹匀后放入20℃二氧化碳生化培养箱中静置培养。待细胞汇集成单层，用0.25％胰蛋白酶消化，根据实验所需进行传代至6孔或96孔细胞培养板等。
[0036]二、IPNV在CHSE
‑
214细胞上最佳增殖方案的研究
[0037]1、不同浓度IPNV感染CHSE
‑
214细胞
[0038]取6孔板，每孔中单层CHSE
‑
214细胞的量为8.0
×
105个，将本实验室分离的IPNV毒株(1.00
×
10
6.00 TCID
50
/0.1ml)利用PBS缓冲液稀释，分别采用100 TCID
50
、1000 TCID
50
、10000 TCID
50
剂量接种单层CHSE
‑
214细胞，每孔病毒液为1ml。于15℃二氧化碳恒温培养箱内孵育1h后，弃去含有病毒的培养液，每孔更换为2mL细胞维持液(为M199培养基含有2％胎牛血清)，于15℃静置培养，每天观察细胞病变情况。
[0039](请根据实际情况补充调整)
[0040]待80％细胞出现病变，收获病毒于
‑
80℃冰箱反复冻融两次，12000g/min 4℃离心15min收集病毒上清液(即为原代病毒)。
[0041]将原代病毒按上述三种剂量接种于6孔细胞培养板并以同样的方法进行连续传代培养，直到第10代。将每次传代收获的病毒上清液分装后保存于
‑
80℃冰箱备用。
[0042]2、IPNV滴度测定
[0043]于1.5mL无菌离心管中用细胞维持液将上述收获的10代病毒上清液作10倍稀释梯度(10
‑1～10
‑8)，接种于96孔细胞培养板的单层CHSE
‑
214细胞(每孔4.0
×
104个细胞)上，每个稀释度8个孔，每孔0.1ml稀释后的病毒上清液，置于15℃二氧化碳生化培养箱中培养7d，之后按Reed
‑
Muench法计算病毒滴度，筛选出病毒滴度高且稳定的最佳接毒剂量。细胞维持液接种的单层CHSE
‑
214细胞为阴性对照。
[0044]结果显示，当IPNV以100 TCID
50
进行接毒时，随着传代次数的增加，滴度逐渐上升，传至第5代时趋于稳定，平均滴度为1.00
×
10
7.50 TCID
50
/0.1ml。以1000TCID
50
接毒，IPNV滴度快速上升，当传至第本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种体外增殖传染性胰脏坏死病毒的方法，包括如下步骤：将传染性胰脏坏死病毒按照剂量100～10000TCID
50
接种于8.0
×
105个大鳞大麻哈鱼胚胎细胞，培养，实现体外增殖传染性胰脏坏死病毒。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述培养的时间为48～84小时。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述培养的温度为15℃。4.根据权利要求1
‑
3中任一所述的方法，其特征在于：所述培养的时间为72小时、所述培养的温度为15℃，所述接种的剂量为100TCID
50
。5.一种制备传染性胰脏坏死病疫苗的方法，包括如下步骤：1)将传染性胰脏坏死病毒按照剂量100～10000TCID
50
接种于8.0
×
105个大鳞大麻哈鱼胚胎细胞，培养，收集上清液，得到体外增殖的传染性胰脏坏死病毒；2)用所...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐黎明，段凯越，邵轶智，赵景壮，任广明，卢彤岩，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，
类型：发明
国别省市：