一种基于冷冻电子显微镜的超快动态观测系统及方法技术方案

本发明专利技术属于冷冻电子显微镜技术领域，公开了一种基于冷冻电子显微镜的超快动态观测系统及方法。本发明专利技术首先利用激光器发射激光脉冲，并激发位于冷冻电子显微镜中的样品产生动力学变化；样品为进行快速冷冻处理后的待观察的生物样品；然后对样品进行成像，获得样品原位变化信息、样品超快动力学变化信息中的至少一种探测信息。本发明专利技术解决了现有技术无法原位观测生物样品在受到外界激励情况下的动态变化过程的问题，对于研究生物样品动态变化过程具有重要意义。具有重要意义。具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种基于冷冻电子显微镜的超快动态观测系统及方法


[0001]本专利技术属于冷冻电子显微镜
，更具体地，涉及一种基于冷冻电子显微镜的超快动态观测系统及方法。

技术介绍

[0002]生物医学在近些年取得了快速的发展，特别是对生物蛋白质、DNA等大分子的研究，对于生命科学研究和药品的研发都意义重大。即使是生物大分子，其尺寸也是纳米尺度的，该如何观测了解他们的结构，是一个难题。
[0003]科学家们一直尝试看清蛋白质的结构，但是长时间以来，只能得到一团模糊的图。最初，使用X射线分析生物结构，为了使用X射线成像，需要蛋白质分子抱团形成稳定的晶体，但是对于人体至关重要的多种蛋白质因为太松散无法抱团形成晶体。人们想到了使用显微镜来放大显示蛋白质结构，显微镜分为光学显微镜和电子显微镜。光学显微镜受到光学衍射极限的限制，光子的波长通常在几百纳米，而蛋白质的分子大小在1至100纳米之间，光学显微镜不能用于蛋白质等生物大分子成像。电子显微镜中电子的波长能够达到光子波长的十万分之一，电子打在蛋白质分子上产生散射，通过散射电子成像，因此电子可以用来观测蛋白质等生物分子。
[0004]但是，电子显微镜依然存在以下几个问题：(1)电子需要被加速到几十万伏高压，需要真空环境来保持稳定的动能；(2)生物样品需要保持在溶液中，如果生物样本处于真空环境中，则溶液会挥发出来污染电子显微镜；(3)蛋白质分子存在大量的氢键，氢键能量较低，高能电子打在蛋白质分子上，容易破坏氢键；(4)生物分子一直在做布朗运动，电子打在非静止的蛋白质分子上后运动变得杂乱无章，得到的图像就是模糊的。
[0005]为了研究生物分子的三维结构，20世纪70年代，人们将生物分子冷冻成玻璃态，当生物分子在液氮冷冻的环境中，特别是高真空环境中保持含水状态，此时使用高能电子束辐照，生物样品也能保持精细的分子结构。到了80年代，Jacques课题组使用一种快速冷冻技术，将蛋白溶液从液态变为玻璃态，通过快速冷冻技术，生物样品可以保持天然的活性状态，从而可以获得接近生理状态的生物大分子结构。Joachim Frank研发了三维重构技术，可以将电镜下二维图像进行分析合并，得到样品清晰的三维结构。
[0006]使用冷冻电镜技术获得三维结构的生物样品数量飞速增长，冷冻电镜技术已经成为生物样品结构解析的主要方法。但是目前冷冻电镜主要用于进行生物结构解析，是一种静态观测，而生物结构中更重要的是动态过程，这方面的研究尚未有合适的工具。因此，有必要提出新的技术手段，弥补目前冷冻电镜技术的不足，使得人们能够原位观测生物样品在受到外界激励情况下的动态变化过程。

技术实现思路

[0007]本专利技术通过提供一种基于冷冻电子显微镜的超快动态观测系统及方法，解决现有技术无法原位观测生物样品在受到外界激励情况下的动态变化过程的问题。
[0008]本专利技术提供一种基于冷冻电子显微镜的超快动态观测方法，包括以下步骤：
[0009]步骤1、利用激光器发射激光脉冲，并激发位于冷冻电子显微镜中的样品产生动力学变化；所述样品为进行快速冷冻处理后的待观察的生物样品；
[0010]步骤2、对样品进行成像，获得样品原位变化信息、样品超快动力学变化信息中的至少一种探测信息；
[0011]其中，利用所述冷冻电子显微镜中的电子枪发射连续电子束，对激光脉冲激发前后的样品进行原位成像，获得所述样品原位变化信息；
[0012]利用激光器发射的激光脉冲激发所述冷冻电子显微镜中的电子枪产生超快电子脉冲，通过不同延时的超快电子脉冲探测样品动力学变化，获得所述样品超快动力学变化信息。
[0013]优选的，所述步骤1中，采用飞秒激光器发射波长为1040nm的激光脉冲，所述1040nm的激光脉冲经过倍频处理后，得到520nm或者260nm的飞秒激光脉冲，激发样品产生动力学变化。
[0014]优选的，所述步骤2中，激发电子枪产生超快电子脉冲的激光脉冲为波长260nm的飞秒激光脉冲。
[0015]优选的，所述步骤2中，通过光学延迟器调整所述激光脉冲和所述超快电子脉冲之间的时间延迟，获得不同时间点样品的动力学变化图像。
[0016]优选的，所述步骤2中，对样品进行成像时的时间分辨率达到300fs～1ps，空间分辨率达到2埃。
[0017]本专利技术提供一种基于冷冻电子显微镜的超快动态观测系统，包括：冷冻电子显微镜、激光器、激发光路和成像光路；
[0018]所述冷冻电子显微镜用于放置固定样品，所述样品为进行快速冷冻处理后的待观察的生物样品；
[0019]所述激光器用于发射具有第一波长的激光脉冲；
[0020]所述激发光路用于将具有第二波长的激光脉冲导入至所述冷冻电子显微镜，激发位于所述冷冻电子显微镜中的样品产生动力学变化；
[0021]所述冷冻电子显微镜用于通过电子枪发射连续电子束，对所述具有第二波长的激光脉冲激发前后的样品进行原位成像，获得样品原位变化信息；
[0022]所述成像光路用于将具有第三波长的激光脉冲导入所述冷冻电子显微镜中，激发所述冷冻电子显微镜中的电子枪产生超快电子脉冲，通过不同延时的超快电子脉冲探测样品动力学变化，获得样品超快动力学变化信息；
[0023]所述第二波长的激光脉冲、所述第三波长的激光脉冲均为所述第一波长的激光脉冲经过倍频处理后得到的激光脉冲。
[0024]优选的，所述激光器为飞秒激光器；所述第一波长为1040nm，所述第二波长为520nm或者260nm，所述第三波长为260nm；所述飞秒激光器的脉宽为300～500fs，功率为50～100mW，重复频率为1～100KHz。
[0025]优选的，所述冷冻电子显微镜的时间分辨率达到300fs～1ps，空间分辨率达到2埃。
[0026]优选的，所述飞秒激光器发射的1040nm的激光脉冲经二倍频晶体后，转换为520nm
的激光脉冲，并包含有1040nm的激光脉冲；经所述二倍频晶体后的激光脉冲经过高反520nm且透射1040nm的第一反射镜后，通过位于所述第一反射镜后方的第一光束吸收器吸收1040nm的激光脉冲，通过设置在所述第一反射镜传输路径上的第二反射镜将520nm的激光脉冲入射至四倍频晶体；
[0027]所述四倍频晶体将520nm的激光脉冲入转换为260nm的激光脉冲，并包含有520nm的激光脉冲；
[0028]经所述四倍频晶体后的激光脉冲经过高反520nm且透射260nm的第三反射镜后分为两路；520nm的激光脉冲经过第四反射镜、第五反射镜后入射至第六反射镜，所述第六反射镜的后方设置有第二光束吸收器，所述第二光束吸收器用于吸收520nm的激光脉冲；260nm的激光脉冲经过第七反射镜、第八反射镜、第九反射镜后入射至半透半反镜；
[0029]所述第六反射镜和所述半透半反镜为可移动元件，根据所述第二波长的选择，移入或移出光路；
[0030]若所述第六反射镜移入光路且所述半透半反镜移出光路，则将520nm的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于冷冻电子显微镜的超快动态观测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、利用激光器发射激光脉冲，并激发位于冷冻电子显微镜中的样品产生动力学变化；所述样品为进行快速冷冻处理后的待观察的生物样品；步骤2、对样品进行成像，获得样品原位变化信息、样品超快动力学变化信息中的至少一种探测信息；其中，利用所述冷冻电子显微镜中的电子枪发射连续电子束，对激光脉冲激发前后的样品进行原位成像，获得所述样品原位变化信息；利用激光器发射的激光脉冲激发所述冷冻电子显微镜中的电子枪产生超快电子脉冲，通过不同延时的超快电子脉冲探测样品动力学变化，获得所述样品超快动力学变化信息。2.根据权利要求1所述的基于冷冻电子显微镜的超快动态观测方法，其特征在于，所述步骤1中，采用飞秒激光器发射波长为1040nm的激光脉冲，所述1040nm的激光脉冲经过倍频处理后，得到520nm或者260nm的飞秒激光脉冲，激发样品产生动力学变化。3.根据权利要求1所述的基于冷冻电子显微镜的超快动态观测方法，其特征在于，所述步骤2中，激发电子枪产生超快电子脉冲的激光脉冲为波长260nm的飞秒激光脉冲。4.根据权利要求1所述的基于冷冻电子显微镜的超快动态观测方法，其特征在于，所述步骤2中，通过光学延迟器调整所述激光脉冲和所述超快电子脉冲之间的时间延迟，获得不同时间点样品的动力学变化图像。5.根据权利要求1所述的基于冷冻电子显微镜的超快动态观测方法，其特征在于，所述步骤2中，对样品进行成像时的时间分辨率达到300fs～1ps，空间分辨率达到2埃。6.一种基于冷冻电子显微镜的超快动态观测系统，其特征在于，包括：冷冻电子显微镜、激光器、激发光路和成像光路；所述冷冻电子显微镜用于放置固定样品，所述样品为进行快速冷冻处理后的待观察的生物样品；所述激光器用于发射具有第一波长的激光脉冲；所述激发光路用于将具有第二波长的激光脉冲导入至所述冷冻电子显微镜，激发位于所述冷冻电子显微镜中的样品产生动力学变化；所述冷冻电子显微镜用于通过电子枪发射连续电子束，对所述具有第二波长的激光脉冲激发前后的样品进行原位成像，获得样品原位变化信息；所述成像光路用于将具有第三波长的激光脉冲导入所述冷冻电子显微镜中，激发所述冷冻电子显微镜中的电子枪产生超快电子脉冲，通过不同延时的超快电子脉冲探测样品动力学变化，获得样品超快动力学变化信息；所述第二波长的激光脉冲、所述第三波长的激光脉冲均为所述第一波长的激光脉冲经过倍频处理后得到的激光脉冲。7.根据权利要求6所述的基于冷冻电子显微镜的超快动态观测系统，其特征在于，所述激光器为飞秒激光器；所述第一波长为1040nm，所述第二波长为520nm或者260nm，所述第三波长为260nm；所述飞秒激光器的脉宽为300～500fs，功率为50～100mW，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘胜，潘俊衡，汪启军，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：