一种骨髓间充质干细胞的体外扩增培养方法技术

本发明专利技术公开了一种骨髓间充质干细胞及其体外扩增培养方法，所述方法包括：将骨髓细胞加入红细胞溶解缓冲液混匀，后进行离心以固液分离，获得固体；其中，所述骨髓细胞与所述红细胞溶解缓冲液的体积比为1：(4.5～5.5)；将所述固体加入原代培养基中进行原代培养，获得培养物；将所述培养物中的所述原代培养更换为无血清培养基以进行传代培养，待细胞长至细胞培养瓶面积的55～70％时，洗涤、消化和终止消化，收集消化后细胞即为P0代细胞；后将所述P0代细胞进行传代并扩增，获得骨髓间充质干细胞。该方法可以提高细胞的存活率和细胞的纯度，增加细胞的增殖速度。胞的增殖速度。胞的增殖速度。

【技术实现步骤摘要】
一种骨髓间充质干细胞的体外扩增培养方法


[0001]本专利技术涉及干细胞提取
，特别涉及一种骨髓间充质干细胞的体外扩增培养方法。

技术介绍

[0002]间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一种能分化为多种类型细胞的多能干细胞。间充质骨髓干细胞目前在许多临床试验中被用来研究其在免疫调节、造血和组织再生方面的潜力。
[0003]目前常用的分离方法有贴壁培养法、密度梯度离心法及流式细胞仪筛选法或免疫磁珠法。
①
贴壁培养法是根据骨髓间充质干细胞贴壁生长，而造血系细胞悬浮生长的特性对二者进行培养分离，同时利用骨髓间充质干细胞较淋巴细胞、单核细胞易脱落的特点，保证骨髓间充质干细胞在短时间内与培养瓶底分开，从而使骨髓间充质干细胞得到进一步纯化，但该法获得的细胞不均一，纯度过低。
②
密度梯度离心法又分为两种：Ficoll分离液法和Percoll分离液法。贴壁培养法和Ficoll分离液法所获得的干细胞生长较快但纯度过低。而Percoll分离液法所获得的干细胞纯度较好，但生长速度较慢而且可能缺失一部分干细胞。
③
流式细胞仪筛选法或免疫磁珠法：根据细胞大小不同或者根据细胞表面的一些特殊标志来分离细胞，该方法分选的细胞纯度高，但对细胞的损伤较大，分选后的细胞活力较弱，存活率低。
[0004]因此，如何有必要开发一种骨髓间充质干细胞的体外扩增培养方法，以解决现有技术中细胞存活率低、细胞纯度低、增值速度慢的技术问题。
专利技术内容
[0005]针对现有技术所存在的技术问题，本专利技术提供了一种骨髓间充质干细胞及其体外扩增培养方法，可以提高细胞的存活率和细胞的纯度，增加细胞的增殖速度。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]本专利技术提供了一种骨髓间充质干细胞的体外扩增培养方法，所述方法包括：
[0008]将骨髓细胞加入红细胞溶解缓冲液混匀，后进行离心以固液分离，获得固体；其中，所述骨髓细胞与所述红细胞溶解缓冲液的体积比为1：(4.5～5.5)；将所述固体加入原代培养基中进行原代培养，获得培养物；
[0009]将所述培养物中的所述原代培养更换为无血清培养基以进行传代培养，待细胞长至细胞培养瓶面积的55～70％时，用生理盐水洗涤，加入胰酶消化液消化，后加入无血清完全培养基终止消化，收集消化后细胞即为P0代细胞；后将所述P0代细胞进行传代并扩增。
[0010]进一步地，所述骨髓细胞与所述红细胞溶解缓冲液的体积比为1：5。
[0011]进一步地，所述骨髓细胞为从年龄18～45岁且无系统性疾病、传染病和性病的志愿者体内无菌获得的完好骨髓细胞。
[0012]进一步地，所述原代培养基为在基础培养基中添加8～12％FBS和(3～5)mM L
‑
谷
氨酰胺。
[0013]进一步地，所述原代培养和所述传代培养的条件均包括：37℃，5％CO2细胞培养箱内培养。
[0014]进一步地，所述原代培养中，在原代培养的第3天后，在相差显微镜下评估所述培养物，所述评估包括：细胞粘附的状态、细胞密度、上清液中的细胞是否存在以及基质/红细胞是否存在。
[0015]进一步地，所述原代培养中，在原代培养的第5天后进行全量换液；所述全量换液包括：吸取掉所述原代培养基中的上清液，后加入磷脂酰胆碱或生理盐水或PBS以进行冲洗，再加入新的原代培养基。
[0016]进一步地，在所述全量换液前，还包括：观察所述培养物的宏观外观，根据所述宏观外观决定是否全量换液，包括：
[0017]若介质不透明或致密且呈黄色，则有污染嫌疑，则不进行全量换液，且取样进行微生物控制；
[0018]若外观清晰，颜色为红色或暗红色，则进行全量换液。
[0019]进一步地，在所述传代培养前，还包括：
[0020]所述全量换液的第3
‑
4天后，观察所述培养物的宏观外观，根据所述宏观外观决定是否更换为无血清培养基以进行传代培养，包括：
[0021]若介质不透明或致密且呈黄色，则有污染嫌疑，则不更换为无血清培养基，且需取样进行微生物控制；
[0022]若外观清晰，颜色为红色或暗红色，则更换为无血清培养基以进行传代培养。
[0023]进一步地，所述P0代细胞进行传代并扩增，包括：
[0024]将所述P0代细胞按10000个/cm2的细胞密度进行传代并扩增至P6代。
[0025]本专利技术实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
[0026]本专利技术实施例提供的一种骨髓间充质干细胞的体外扩增培养方法，包括：将骨髓细胞加入红细胞溶解缓冲液混匀，后进行离心以固液分离，获得固体；其中，所述骨髓细胞与所述红细胞溶解缓冲液的体积比为1：(4.5～5.5)；将所述固体加入原代培养基中进行原代培养，获得培养物；其中，所述原代培养中，在原代培养的第5天后进行全量换液；将所述培养物中的所述原代培养更换为无血清培养基以进行传代培养，待细胞长至细胞培养瓶面积的55～70％时，洗涤、消化和终止消化，收集消化后细胞即为P0代细胞；后将所述P0代细胞进行传代并扩增。本专利技术首先将骨髓细胞加入红细胞溶解缓冲液混匀，后进行离心以固液分离获得的固体再进行原代培养和传代培养，所述骨髓细胞与所述红细胞溶解缓冲液的体积比为1：(4.5～5.5)；所述红细胞溶解缓冲液不仅可以在提取骨髓的时候立马去除骨髓里的红细胞而且提高细胞的存活率，增加细胞的增殖速度。
附图说明
[0027]为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术实施例的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
[0028]图1为实施例3中P0代培养2d的骨髓干细胞换液之前存在的红细胞状态图；
[0029]图2为实施例2中P0代培养2d骨髓干细胞换液之前不存在的细胞状态图
[0030]图3为实施例2中骨髓干细胞P0代培养4d的细胞状态图；
[0031]图4为实施例2中骨髓干细胞P0代培养7d的细胞状态图；
[0032]图5为实施例1中骨髓干细胞P1代培养24h的细胞状态图；
[0033]图6为实施例1中骨髓干细胞P3代培养4d的细胞状态图；
[0034]图7为本专利技术实施例提供的一种骨髓间充质干细胞的体外扩增培养方法的流程图。
具体实施方式
[0035]下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本专利技术。
[0036]以下各实施例，仅用于说明本专利技术，但不止用来限制本专利技术的范围。基于本专利技术中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本专利技术的保护范围。
[003本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种骨髓间充质干细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，所述方法包括：将骨髓细胞加入红细胞溶解缓冲液混匀，后进行离心以固液分离，获得固体；其中，所述骨髓细胞与所述红细胞溶解缓冲液的体积比为1：(4.5～5.5)；将所述固体加入原代培养基中进行原代培养，获得培养物；将所述培养物中的所述原代培养更换为无血清培养基以进行传代培养，待细胞长至细胞培养瓶面积的55～70％时，洗涤、消化和终止消化，收集消化后细胞即为P0代细胞；后将所述P0代细胞进行传代并扩增，获得骨髓间充质干细胞。2.根据权利要求1所述的一种骨髓间充质干细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，所述骨髓细胞与所述红细胞溶解缓冲液的体积比为1：5。3.根据权利要求1所述的一种骨髓间充质干细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，所述骨髓细胞为从年龄18～45岁且无系统性疾病、传染病和性病的志愿者体内无菌获得的完好骨髓细胞。4.根据权利要求1所述的一种骨髓间充质干细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，所述原代培养基为在基础培养基中添加8～12％FBS和(3～5)mM L
‑
谷氨酰胺。5.根据权利要求1所述的一种骨髓间充质干细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，所述原代培养和所述传代培养的条件均包括：37℃，5％CO2细胞培养箱内培养。6.根据权利要求1所述的一种骨髓间充质干细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，所述原代培养中，在原代培养的第3天后，在相差显微镜下评估...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘招，博古，周天乐，
申请(专利权)人：武汉万海细胞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：