一种产蔗糖磷酸化酶的枯草芽孢杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种产蔗糖磷酸化酶的枯草芽孢杆菌及其应用，本发明专利技术的枯草芽孢杆菌斯氏亚种SLLSM1菌株从从广西来宾甘蔗地的土壤中分离而得，其保藏编号为CCTCC NO：2021697，保藏日期：2021年6月9日，保藏地址为：中国、武汉、武汉大学，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，该菌株具有较高产酶活力，且产蔗糖磷酸化酶稳定性好，该菌产酶的酶活达195.3U，制备出的α

【技术实现步骤摘要】
一种产蔗糖磷酸化酶的枯草芽孢杆菌及其应用


[0001]本专利技术涉及微生物
，具体涉及一种产蔗糖磷酸化酶的枯草芽孢杆菌及其应用。

技术介绍

[0002]α
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熊果苷(α
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Ar)是一种高价值糖苷，广泛应用于化妆品和制药行业，是一种安全可靠的美白剂。酶法是生产α
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熊果苷的主要方法，因其原料较简单、生产周期较短而被广泛使用，但由于缺少高催化效率的酶，目前α
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熊果苷的产量受到了很大的限制。
[0003]本专利技术利用自行筛选的蔗糖磷酸化酶酶法催化合成，即蔗糖磷酸化酶酶液催化蔗糖和氢醌(对苯二酚)合成α
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熊果苷，此反应具有绿色高效、反应温和的优势。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供了一种产蔗糖磷酸化酶的枯草芽孢杆菌及其应用。
[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术采用了如下的技术方案：
[0006]一株枯草芽孢杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilis subsp.Spizizenii)菌株SLLSM1，其保藏编号为CCTCC NO：2021697，保藏日期：2021年6月9日，保藏地址为：中国、武汉、武汉大学，保藏单位：中国典型培养物保藏中心。
[0007]进一步说明，所述的枯草芽孢杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilis subsp.Spizizenii)菌株SLLSM1，所述菌株从广西来宾甘蔗地的土壤中分离而得。
[0008]本申请还提供一种包含如上所述的枯草芽孢杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilis subsp.Spizizenii)菌株SLLSM1的微生物制剂。
[0009]进一步说明，所述的微生物制剂，所述微生物制剂中含有活菌数不低于1.0
×
108个/mL的枯草芽孢杆菌斯氏亚种SLLSM1细胞。
[0010]本申请还提供一种生产蔗糖磷酸化酶的方法，具体的方法为：在无菌操作下，用灭菌接种环接枯草芽孢杆菌斯氏亚种SLLSM1到已高温灭菌的发酵培养基(pH＝4.0)中，在37℃、180r/min摇床恒温发酵培养24h后，取发酵液按照接种量8％接入新的发酵培养基中摇床恒温37℃培养72h，经10000r/min、15min离心机离心得到上清液即为蔗糖磷酸化酶粗酶液。
[0011]进一步说明，所述发酵培养基的配方为：硝酸钾70g/L、酵母粉70g/L、葡萄糖90g/L、磷酸氢二钾5g/L、H2O 1000mL。
[0012]本申请还提供一种所述的枯草芽孢杆菌斯氏亚种SLLSM1在生产α
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熊果苷产品上的应用。
[0013]本申请还提供一种制备如上所述α
‑
熊果苷的方法，所述方法包括如下步骤：
[0014](1)、将保存的枯草芽孢杆菌斯氏亚种SLLSM1接种于斜面培养基上，置于37℃恒温培养箱培养2天，获得活化菌种，用无菌水洗脱菌种获得枯草芽孢杆菌斯氏亚种SLLSM1菌悬
浮液，将菌种悬浮液接入摇瓶发酵培养基，在37℃、180r/min摇床恒温培养72h，经10000r/min、15min离心机离心得到上清液即为蔗糖磷酸化酶粗酶液；
[0015]所述斜面培养基为PS培养基；所述PS培养基配方为：0.5g蔗糖、0.02g KH2PO4、0.61g Na2HPO4、0.1g NH4Cl、0.01g酵母膏、0.05g MgSO4·
7H2O、0.5mgCaCl2、琼脂粉1g，100mL蒸馏水，自然pH，121℃湿热灭菌；
[0016]所述摇瓶发酵培养基配方为：硝酸钾70g/L、酵母粉70g/L、葡萄糖90g/L、磷酸氢二钾5g/L H2O 1000mL；
[0017](2)、在温度为50℃，加入30mmol/L、pH为6.0磷酸盐缓冲液10mL，蔗糖5g，氢醌50g/L，再加入3mL粗酶液，180r/min摇床避光反应5h，即可得到α
‑
熊果苷。
[0018]进一步说明，所述枯草芽孢杆菌斯氏亚种SLLSM1菌悬浮液浓度为1.0
×
108个/ml。
[0019]本申请还公开上述所述的枯草芽孢杆菌斯氏亚种SLLSM1在食品、化妆品或制药领域中的应用。
[0020]本专利技术磷酸盐缓冲液可以在市场上购买，产至合肥博美生物科技有限责任公司。
[0021]综上所述，由于采用了上述技术方案，本专利技术的有益效果是：
[0022]本专利技术枯草芽孢杆菌斯氏亚种SLLSM1菌是从广西来宾甘蔗地的土壤中分离筛选出一株菌，研究发现该菌是产蔗糖磷酸化酶的枯草芽孢杆菌斯氏亚种SLLSM1，为了研究该菌的产酶能力，做了单因素和正交实验的研究，通过本申请人研究确定枯草芽孢杆菌斯氏亚种SLLSM1发酵产酶的最佳条件为：发酵时间72h，接种量量为8％，发酵温度为37℃，硝酸钾70g/L、酵母粉70g/L、葡萄糖90g/L、磷酸氢二钾5g/L，初始pH为4.0；该菌产酶的酶活达195.3U/mL，可见该菌具有产酶活力高、稳定性好；并利用该菌产酶转化制备α
‑
熊果苷产量达到58.84g/L，且α
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熊果苷摩尔产率为59.48％。
【附图说明】
[0023]图1为本申请实施例的枯草芽孢杆菌斯氏亚种SLLSM1菌株在平皿上的形态图；
[0024]图2为不同发酵时间对枯草芽孢杆菌斯氏亚种产酶能力的影响图；
[0025]图3为不同碳源对枯草芽孢杆菌斯氏亚种产酶能力的影响图；
[0026]图4为不同葡萄糖浓度对枯草芽孢杆菌斯氏亚种产酶能力的影响图；
[0027]图5为不同无机氮源对枯草芽孢杆菌斯氏亚种产酶能力的影响图；
[0028]图6为不同KNO3浓度对枯草芽孢杆菌斯氏亚种产酶能力的影响图；
[0029]图7为不同有机氮源对枯草芽孢杆菌斯氏亚种产酶能力的影响图；
[0030]图8为不同酵母粉浓度对枯草芽孢杆菌斯氏亚种产酶能力的影响图；
[0031]图9为不同不同无机盐离子对枯草芽孢杆菌斯氏亚种产酶能力的影响图；
[0032]图10为不同发酵培养基pH对枯草芽孢杆菌斯氏亚种产酶能力的影响图；
[0033]图11为菌种不同接种量对枯草芽孢杆菌斯氏亚种产酶能力的影响图；
[0034]图12为不同发酵温度对枯草芽孢杆菌斯氏亚种产酶能力的影响图。
【具体实施方式】
[0035]本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
[0036]本说明书(包括任何附加权利要求、摘要)中公开的任一特征，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。
[0037]一、菌种的筛选
[0038]土样取自广西来宾甘蔗地的土壤，以PS培养基形成筛选培养基筛选产蔗糖本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株枯草芽孢杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilis subsp.Spizizenii)菌株SLLSM1，其保藏编号为CCTCC NO：2021697，保藏日期：2021年6月9日，保藏地址为：中国、武汉、武汉大学，保藏单位：中国典型培养物保藏中心。2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilis subsp.Spizizenii)菌株SLLSM1，其特征在于，所述菌株从广西来宾甘蔗地的土壤中分离而得。3.包含如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilis subsp.Spizizenii)菌株SLLSM1的微生物制剂。4.如权利要求3所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物制剂中含有活菌数不低于1.0
×
108个/mL的枯草芽孢杆菌斯氏亚种SLLSM1细胞。5.一种生产蔗糖磷酸化酶的方法，其特征在于，具体的方法为：在无菌操作下，用灭菌接种环接枯草芽孢杆菌斯氏亚种SLLSM1到已高温灭菌的发酵培养基(pH＝4.0)中，在37℃、180r/min摇床恒温发酵培养24h后，取发酵液按照接种量8％接入新的发酵培养基中摇床恒温37℃培养72h，经10000r/min、15min离心机离心得到上清液即为蔗糖磷酸化酶粗酶液。6.如权利要求5所述一种生产蔗糖磷酸化酶的方法，其特征在于，所述发酵培养基的配方为：硝酸钾70g/L、酵母粉70g/L、葡萄糖90g/L、磷酸氢二钾5g/L、H2O7 1000mL。7.如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌斯氏亚种SLLSM...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈显玲，苏龙，蒋才云，覃逸明，柳富杰，唐森，周永升，
申请(专利权)人：广西科技师范学院，
类型：发明
国别省市：