小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养液及制备方法技术

本发明专利技术公开了一种小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养液及制备方法，该培养液由以下化合物和对应的用量配制而成：磷酸二氢钾1～1.5g/L，尿素1.3～1.7g/L，硼酸80～120mg/L，柠檬酸16～24mg/L，2,4

【技术实现步骤摘要】
小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养液及制备方法


[0001]本专利技术涉及农业杂交
，特别涉及一种小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养液及制备方法。

技术介绍

[0002]双单倍体(doubled haploid，DH)技术可使杂合育种材料在一个世代纯合稳定，加速育种进程，成倍提高育种效率。把DH技术与分子设计育种整合构建“快速、精准”高效育种技术体系，已成为作物高效育种技术的一个重要发展方向(Li at al.,2020；Kalinowska et al.,2019；Kelliher et al.,2019；Wang et al.,2019)。此外，单倍体和双单倍体在基因功能、转基因研究以及遗传群体构建等方面也有重要应用价值(Grewal et al.,2021；Liu et al.,2020)。
[0003]双单倍体由单倍体经人工或自然染色体加倍产生。随着单倍体诱导技术和染色体加倍技术不断完善，双单倍体技术已在玉米(Kelliheret al.,2017；Liu et al.,2017)、水稻(Liu et al.,2017)、油菜(Forster et al.,2007；李栒等，2003)、大麦(Kasha et al.,1970,)和小麦(Liu et al.,2002)等作物育种上广泛应用。
[0004]小麦
×
玉米远缘杂交是国际上公认的产生小麦单倍体效率最高的途径之一，已在国内外小麦遗传育种上广泛研究、应用(Skrzypek et al.,2018；Ishii et al.,2016；Niu et al.,2014；Laurie et al.,1986)。
[0005]该技术在育种上广泛应用的首要条件是单倍体胚的诱导率(或简称“得胚率”，指平均每授粉100个小麦小花实际能得到的单倍体胚个数)高且稳定，一般应在50％以上，越高越好。因为最终要得到足够数量的双单倍体苗，首先必须有足够数量的胚。研究表明，单倍体胚的诱导率受麦穗离体培养的营养成分影响，即穗培养液配方的影响。
[0006]前期研究麦穗离体培养液可诱导单倍体胚约30％诱导率，配方包括磷酸二氢钾2.5g/L，尿素3g/L，亚硫酸8ml/L，硝酸银100mg/L，2,4
‑
D 100mg/L，蔗糖40g/L(专利号：ZL201410000309.0)，成胚率较低，配方中有硝酸银和亚硫酸成分，银属于重金属，亚硫酸易挥发、气味刺鼻，都属于危险化学试剂，对操作人员身体健康存在潜在威胁，培养后的剩余培养液需进行集中特殊处理，且该配方间隔3天需更换1次营养液，操作繁琐。另外，该配方中有硝酸银，银离子易与其他离子形成沉淀，影响培养效果。
[0007]小麦玉米杂交诱导小麦双单倍体技术操作过程中，单倍体胚检测接种是整个技术体系中最为耗时耗工的环节，需要在显微镜下检测每个颖果是否有胚，将胚转接到培养基上进行培养。由于成胚率仅约30％，即70％颖果都不含胚，但仍需人工在显微镜下进行鉴定，不仅增加了工作量还增加了接种时污染风险。鉴于此我们专利技术了颖果是否有胚检测装置(专利号：ZL201821703150.9)，可以无需再显微镜下检测颖果中是否有胚，使接种效率提高2倍以上，但检测效果依赖颖果质量(饱满度，也就是千粒重，千粒重越高饱满度越好)，颖果质量越好，越有利于检测。
[0008]因此，需要研究一种能够大幅提高小麦玉米杂交诱导小麦单倍体成胚率的颖果千
粒重的离体培养液配方，提高小麦双单倍体生产效率，降低双单倍体单位生产成本。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的是提供一种提高小麦玉米杂交诱导单倍体胚成胚率和颖果千粒重的麦穗离体培养液及制备方法，不含有亚硫酸和硝酸银成分且所用化合物含量减半，更换营养液间隔由3天延长至7天且只需更换1次，减少人工投入，降低双单倍体生产成本，并且有效提高成胚率，提高颖果千粒重和饱满度。
[0010]本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
[0011]一种提高小麦玉米杂交诱导单倍体胚成胚率和颖果千粒重的麦穗离体培养液，该培养液配方由以下化合物和对应的用量配制而成：磷酸二氢钾1～1.5g/L，尿素1.3～1.7g/L，硼酸80～120mg/L，柠檬酸16～24mg/L，2,4
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D 46～54mg/L，蔗糖15～25g/L。
[0012]进一步优选：该培养液由以下化合物和对应的用量配制而成：培养液配方磷酸二氢钾1.25g/L，尿素1.5g/L，硼酸100mg/L，柠檬酸20mg/L，2,4
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D 50mg/L，蔗糖20g/L。
[0013]本专利技术所述的小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养液的制备方法，包括以下步骤：
[0014]1)配制磷酸二氢钾40
×
母液，即按照营养液中磷酸二氢钾的含量称量40份，1L容量瓶放入500ml蒸馏水，将称量的磷酸二氢钾放入容量瓶中溶解后，定容至1L，放入冰箱保鲜层备用；
[0015]2)配制尿素40
×
母液，即按照营养液中尿素的含量称量40份，1L容量瓶放入500ml蒸馏水，将称量的尿素放入容量瓶中溶解后，定容至1L，放入冰箱保鲜层备用；
[0016]3)配制硼酸50
×
母液，即按照营养液中硼酸的含量称量50份，1L容量瓶放入500ml蒸馏水，将称量的硼酸放入容量瓶中溶解后，定容至1L，放入冰箱保鲜层备用；
[0017]4)配制2,4
‑
D 40
×
母液，即按照营养液中2,4
‑
D的含量称量40份，放入50ml无水乙醇中，待2,4
‑
D完全溶解倒入1L容量瓶定容至1L，放入冰箱保鲜层备用；
[0018]5)配制柠檬酸50
×
母液，即按照营养液配方中柠檬酸的含量称量50份，1L容量瓶放入500ml蒸馏水，将称量的柠檬酸放入容量瓶中溶解后，定容至1L，放入冰箱保鲜层备用；
[0019]6)营养液配制
[0020]取磷酸二氢钾配40
×
母液25ml；
[0021]取尿素40
×
母液25ml；
[0022]取硼酸50
×
母液20ml；
[0023]取2,4
‑
D 40
×
母液25ml；
[0024]取柠檬酸50
×
母液20ml；
[0025]取蔗糖20g；
[0026]将上述成分依次放入盛有885ml蒸馏水烧杯中，待蔗糖完全融化摇匀，1L营养液即配制完成。
[0027]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0028]其一、与现有离体培养培养液相比，所用化合物含量减半，不含有亚硫酸和硝酸银成分，没有亚硫酸挥发刺激性气体、银离子生成沉淀影响培养效果，没有处理剩余含银离子培养液的麻烦；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养液，其特征在于，该培养液由以下化合物和对应的用量配制而成：磷酸二氢钾1～1.5g/L，尿素1.3～1.7g/L，硼酸80～120mg/L，柠檬酸16～24mg/L，2,4
‑
D46～54mg/L，蔗糖15～25g/L。2.根据权利要求1所述的一种小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养液，其特征在于，该培养液由以下化合物和对应的用量配制而成：磷酸二氢钾1.25g/L，尿素1.5g/L，硼酸100mg/L，柠檬酸20mg/L，2,4
‑
D50mg/L，蔗糖20g/L。3.根据权利要求1或2任意一项所述的一种小麦玉米杂交诱导单倍体胚的麦穗离体培养液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)配制磷酸二氢钾40
×
母液，即按照营养液配方中磷酸二氢钾的含量称量40份，1L容量瓶放入500ml蒸馏水，将称量的磷酸二氢钾放入容量瓶中溶解后，定容至1L，放入冰箱保鲜层备用；2)配制尿素40
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母液，即按照营养液配方中尿素的含量称量40份，1L容量瓶放入500ml蒸馏水，将称量的尿素放入容量瓶中溶解后，定容至1L，放入冰箱保鲜层备用；3)配制硼酸50

【专利技术属性】
技术研发人员：李宏生，杨忠慧，李绍祥，杨木军，刘琨，赵红，
申请(专利权)人：云南省农业科学院粮食作物研究所，
类型：发明
国别省市：