一种基于催化发夹组装扩增和电感耦合等离子体质谱检测微小RNA的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于催化发夹组装扩增和电感耦合等离子体质谱检测微小RNA的方法。包括制备用稀土金属标记的DNA探针HRP，使铥元素标记到HRP上；混合DNA探针HCP和清洗过的磁珠，使DNA探针HCP修饰到磁珠上；将铥元素标记的HRP、修饰有HCP的磁珠和待测微小RNA混合，使HRP与HCP完成杂交，铥元素标记的HRP被固定在磁珠表面，完成催化发夹组装扩增等步骤；本发明专利技术提供了一种稀土金属标记DNA探针的方法，该合成方法步骤简单，条件温和，纯化方便，全部完成所需要的时间较短；本发明专利技术使用链霉亲和素磁珠作为固定相来捕获DNA探针，分离操作简单，效率较高。率较高。率较高。

【技术实现步骤摘要】
一种基于催化发夹组装扩增和电感耦合等离子体质谱检测微小RNA的方法


[0001]本专利技术属于基因检测
，具体涉及一种基于催化发夹组装扩增和电感耦合等离子体质谱检测微小RNA的方法。

技术介绍

[0002]癌症是导致人类死亡的最大病因之一，全世界每年新增超过1000万例癌症病例。目前医学上对恶性肿瘤的诊断在很大程度上仍依赖于组织切片的形态特征，这种具有侵入性的诊断方法难以在早期得到准确的结果。这促使肿瘤诊断从解剖病理学向分子病理学转变，即利用某种肿瘤标志物来进行诊断。
[0003]微小RNA(miRNA)是一类小的、内源性的非编码单链RNA分子，长度大约为18～25个碱基对，其序列具有高度的保守性。miRNA最早于1993年在秀丽隐杆线虫中发现(lin
‑
4)，随后在植物、动物和一些病毒中相继发现新的miRNA。迄今为止已经在自然界发现超过3万种miRNA，其中从人类基因中发现的超过2500种。miRNA存在于各种类型的人体细胞、体液环境中，能够靶向作用于约60％的哺乳动物基因，通过与信使RNA(mRNA)的互补配对来调控基因在转录后的表达，维持细胞和组织的生理稳态。相应的，不同miRNA的异常表达与多种恶性肿瘤的生长情况高度相关，而外周血中的循环miRNA能在极端温度、pH甚至RNA酶存在的情况下长期保持稳定，这使得miRNA可以作为理想的非侵入性肿瘤诊断标志物，成为近年来研究的热点。
[0004]尽管miRNA作为生物标志物具有非常多的优点，但链长短、总RNA样品中丰度低，家族成员之间的序列同源性使miRNA的定性定量分析变得较为困难。用于miRNA分析的传统方法主要是Northern印迹法、实时定量聚合酶链式反应(qRT
‑
PCR)和微阵列分析法。这些经典的传统方法虽然能够解决问题，但都存在着一些缺陷：Northern印迹法所需样品的总RNA量大(5～25mg)，步骤繁多，分析过程冗长，使用的化学试剂有放射性或致癌的风险；qRT
‑
PCR是一种非等温扩增方法，耗时耗力，分析成本昂贵，有非特异性扩增的干扰存在；微阵列分析法对高序列同源性样品的选择性较差，容易产生交叉杂交，且高通量分析的代价是成本的大幅提高。
[0005]为了克服传统方法的这些不足，国内外的研究者开发了诸如杂交链式反应(HCR)、滚环扩增(RCA)等信号放大策略。这些新的扩增方法需要设计复杂的检测探针来实现等温扩增，减少了核酸酶的使用，整个过程相较于传统的PCR而言更为精简。但这些信号放大策略面临的问题是一些非特异性产物的存在，这会导致检测到的背景信号较大。
[0006]因此设计合适的探针序列，寻找简单易行的信号放大策略并结合高灵敏度的信号检测方法对高同源性的miRNA特异性地检测将是一项富有意义及挑战性的工作，对该领域的深入研究能对恶性肿瘤早期非侵入性诊断的发展做出贡献。

技术实现思路

[0007]鉴于此，本专利技术的目的是提供一种基于催化发夹组装扩增反应(CHA)和电感耦合等离子体质谱(ICP
‑
MS)检测miRNA的方法，实现对miRNA分子高灵敏度、高特异性的检测。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0009]本专利技术公开了一种基于催化发夹组装扩增和电感耦合等离子体质谱检测微小RNA的方法，包括以下步骤：
[0010]1)制备用稀土金属标记的DNA探针HRP，使铥元素标记到HRP上；
[0011]2)混合DNA探针HCP和清洗过的磁珠，使DNA探针HCP修饰到磁珠上；
[0012]3)将铥元素标记的HRP、修饰有HCP的磁珠和待测微小RNA混合，使HRP与HCP完成杂交，铥元素标记的HRP被固定在磁珠表面，完成催化发夹组装扩增；
[0013]4)清洗步骤2)所得磁珠后将磁珠悬浮在分子生物级无酶水中，加热使HRP
‑
HCP双链解旋，磁分离后取出含有铥元素的上清液，溶解于硝酸溶液中。
[0014]5)使用电感耦合等离子体质谱测定硝酸溶液中铥元素的信号强度。
[0015]作为进一步地改进，本专利技术的步骤1)的具体步骤如下：
[0016]1)将一端修饰有巯基的发夹形DNA探针HRP与三
‑
(2
‑
甲酰乙基)膦盐酸盐在缓冲液A中混合，35～40℃振荡条件下反应0.5～1h，还原巯基耦联产生的二硫键；
[0017]2)将双功能络合剂1,4,7,10
‑
四氮杂环十二烷
‑
1,4,7
‑
三乙酸
‑
10
‑
马来酰亚胺基乙酰胺加入步骤1)反应后的混合液，在35～40℃振荡条件下反应2h以上，马来酰亚胺与巯基反应，使1,4,7,10
‑
四氮杂环十二烷
‑
1,4,7
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三乙酸
‑
10
‑
马来酰亚胺基乙酰胺修饰到HRP上；
[0018]3)使用NAP
‑
5体积排阻柱对步骤2)反应所得溶液进行纯化，除去过量的三
‑
(2
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甲酰乙基)膦盐酸盐、1,4,7,10
‑
四氮杂环十二烷
‑
1,4,7
‑
三乙酸
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10
‑
马来酰亚胺基乙酰胺和小分子盐类，分子生物级无酶水洗脱得到1,4,7,10
‑
四氮杂环十二烷
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1,4,7
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三乙酸
‑
10
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马来酰亚胺基乙酰胺修饰的HRP水溶液，通过冷冻干燥得到其干粉；
[0019]4)将步骤3)得到的干粉与氯化铥在缓冲液B中混合，35～40℃振荡条件下反应1h以上，使三价铥离子络合到1,4,7,10
‑
四氮杂环十二烷
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1,4,7
‑
三乙酸
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10
‑
马来酰亚胺基乙酰胺的氮杂环中；
[0020]5)将乙二胺四乙酸加入步骤4)反应后的混合液，在35～40℃振荡条件下反应15～30min，使过量的铥离子被络合掉；
[0021]6)使用NAP
‑
5体积排阻柱对步骤5)反应所得溶液进行纯化，除去过量乙二胺四乙酸
‑
铥的络合物和小分子盐类，分子生物级无酶水洗脱得到铥元素标记的HRP水溶液。
[0022]作为进一步地改进，本专利技术所述的缓冲液A为0.5mol
·
L
‑1pH 6.8的乙酸铵，缓冲液B为0.5mol
·
L
‑1pH 5.8的乙酸铵，两种缓冲液的pH均由冰乙酸调节得到。
[0023]作为进一步地改进，本专利技术所述的步骤1)中，DNA探针与三
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(2
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于催化发夹组装扩增和电感耦合等离子体质谱检测微小RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)制备用稀土金属标记的DNA探针HRP，使铥元素标记到HRP上；2)混合DNA探针HCP和清洗过的磁珠，使DNA探针HCP修饰到磁珠上；3)将铥元素标记的HRP、修饰有HCP的磁珠和待测微小RNA混合，使HRP与HCP完成杂交，铥元素标记的HRP被固定在磁珠表面，完成催化发夹组装扩增；4)清洗所述步骤2)所得磁珠后将磁珠悬浮在分子生物级无酶水中，加热使HRP
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HCP双链解旋，磁分离后取出含有铥元素的上清液，溶解于硝酸溶液中。5)使用电感耦合等离子体质谱测定硝酸溶液中铥元素的信号强度。2.根据权利要求1所述的基于催化发夹组装扩增和电感耦合等离子体质谱检测微小RNA的方法，其特征在于，所述的步骤1)的具体步骤如下：1)将一端修饰有巯基的发夹形DNA探针HRP与三
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甲酰乙基)膦盐酸盐在缓冲液A中混合，35～40℃振荡条件下反应0.5～1h，还原巯基耦联产生的二硫键；2)将双功能络合剂1,4,7,10
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四氮杂环十二烷
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马来酰亚胺基乙酰胺加入步骤1)反应后的混合液，在35～40℃振荡条件下反应2h以上，马来酰亚胺与巯基反应，使1,4,7,10
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马来酰亚胺基乙酰胺修饰到HRP上；3)使用NAP
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5体积排阻柱对步骤2)反应所得溶液进行纯化，除去过量的三
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甲酰乙基)膦盐酸盐、1,4,7,10
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四氮杂环十二烷
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马来酰亚胺基乙酰胺和小分子盐类，分子生物级无酶水洗脱得到1,4,7,10
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三乙酸
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马来酰亚胺基乙酰胺修饰的HRP水溶液，通过冷冻干燥得到其干粉；4)将步骤3)得到的干粉与氯化铥在缓冲液B中混合，35～40℃振荡条件下反应1h以上，使三价铥离子络合到1,4,7,10
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三乙酸
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马来酰亚胺基乙酰胺的氮杂环中；5)将乙二胺四乙酸加入步骤4)反应后的混合液，在35～40℃振荡条件下反应15～30min，使过量的铥离子被络合掉；6)使用NAP
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5体积排阻柱对步骤5)反应所得溶液进行纯化，除去过量乙二胺四乙酸
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铥的络合物和小分子盐类，分子生物级无酶水洗脱得到铥元素标记的HRP水溶液。3.根据权利要求2所述的基于催化发夹组装扩增和电感耦合等离子体质谱检测微小RNA的方法，其特征在于，所述的缓冲液A为0.5mol
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1 pH 6.8的乙酸铵，缓冲液B为0.5mol
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1 pH 5.8的乙酸铵，两种缓冲液的pH均由冰乙酸调节得到。4.根据权利要求2所述的基于催化发夹组装扩增和电感耦合等离子体质谱检测微小R...

【专利技术属性】
技术研发人员：王敏，沈嘉玮，姚波，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：