基于重组生物聚合物的组合物及其作为生物墨水的用途制造技术

本发明专利技术涉及包含重组生物聚合物的组合物，所述重组生物聚合物由“弹性蛋白样重组体”(ELR)类型的单体、包含“丝蛋白”序列的单体和/或包含属于称为拉链蛋白的天然蛋白类别的HLF序列的单体的组合制成。所述组合物可用作3D打印的生物墨水。此外，本发明专利技术还涉及用于获得本发明专利技术的组合物以及3D生物材料的方法，并且涉及该组合物和所获得的生物材料的不同用途。该组合物和所获得的生物材料的不同用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基于重组生物聚合物的组合物及其作为生物墨水的用途


[0001]本专利技术涉及组合物，其包含由弹性蛋白样重组(ELR)单体合成的重组生物聚合物，所述重组生物聚合物包含源自家蚕Bombyx mori的被称为“丝蛋白(silk)”的序列，和/或包含被称为HLF的序列且属于称为拉链蛋白(zipper)的一类天然蛋白质的单体。这些组合物可用作3D打印的生物墨水。另外，本专利技术涉及用于获得本专利技术的组合物的方法，3D生物材料以及该组合物和包含该组合物的生物材料的不同用途。

技术介绍

[0002]3D生物打印技术包括立体平版印刷、基于喷墨的生物打印、基于激光的生物打印和基于挤出的生物打印，后一种技术应用最为广泛。在基于挤出的生物打印中，将水凝胶引入墨盒内，并通过压力将其挤出到表面上。印刷结构是通过借助CAM
–
CAD(计算机辅助制造
‑
计算机辅助设计)软件进行时空运动控制，对材料进行逐层沉积而制成的。
[0003]到目前为止，已经使用挤出技术进行了大量研究来模仿组织，例如骨骼、心脏组织、软骨、肝脏、肺、神经组织、皮肤和胰腺组织(Ozbolat,I.T.等人，Drug Discovery Today,2016.21(8):p.1257
‑
1271)。它也已经用于执行疾病和药物释放的体外建模(Vanderburgh，J.等人，Ann Biomed Eng，2017.45(1)：p.164
‑
179)。
[0004]材料要满足以便可以在3D生物打印中使用的参数，是指印刷过程，尤其是可印刷性，它受诸如流变性质(粘度、假塑性、粘弹性和屈服强度)和交联机制等理化参数的影响；以及允许它们用作生物医学材料的那些特性，例如生物相容性，并指出其降解动力学必须与细胞形成其自身细胞外基质的能力相一致，并且其降解产物对其无毒。
[0005]有许多材料用作生物墨水，其中包括随着时间的推移在组织工程中使用的具有水凝胶结构的材料。这些用作生物墨水的水凝胶分为天然水凝胶(例如：藻酸盐、明胶、琼脂糖、透明质酸、壳聚糖、脱细胞的细胞外基质，DNA肽和结构蛋白，例如胶原蛋白、丝素蛋白和纤维蛋白)和合成水凝胶(例如：聚(乳酸
‑
共
‑
乙醇酸)(PLGA)、普朗尼克酸、聚乙二醇(PEG)、聚(L
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乳酸)(PLA)和聚(ε
‑
己内酯)(PCL))。尽管基于天然生物聚合物、合成生物聚合物，甚至两者的混合物，现有的生物墨水种类繁多，但仍然存在许多缺点，限制了它们的使用，特别是在印刷基质的机械和结构性能方面，在某些情况下显示出很高的亲水性，亲水性限制了它们在细胞中的使用，高粘度，高粘度阻碍了它们的印刷，低形状完整性，快速胶凝和交联等。尚未克服的另一个缺点还在于缺乏允许细胞相互作用的生物相容性或生物活性结构域。
[0006]为了解决基于聚合物的生物墨水的上述缺点，出现了几种策略：(1)稳定结构的胶凝方法，主要基于物理过程(离子相互作用，氢键或疏水相互作用)，化学过程(通过化学反应产生的共价键))或两者的组合(Jungst，T.等人，Chemical Reviews.2016 116(3)：1496
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1539)；(2)多组分或混合墨水的使用，通常试图弥补一种墨水的结构缺陷，同时又具有另一种墨水的良好可印刷性，并且在现有技术中几乎所有现有的生物墨水都存在混合物(Chimene,D.等人，Ann Biomed Eng.2016，44(6)：2090
‑
2102；(3)使用牺牲性墨水为印刷提
供更大的结构和支撑，以及(4)使用合成材料作为支持物。
[0007]迄今为止，有几种可商购的生物墨水组合物，例如：基于明胶聚合物并结合不同生长因子的Gel4Cell(Bioink Solutions，Inc.)，基于纳米纤维素和藻酸盐的CELLINK(CELLINK)，分别基于PEG/明胶/透明质酸和磷酸钙的Bioink和Osteoink(RegenHU)，以及分别基于Pluronic F127和甲基丙烯酸明胶的Bio127和bioGel(Biobot)。这种类型的生物墨水的缺点在于，由于形成它们的明胶聚合物是从动物胶原水解中获得的且因此不能确保它们的相似性，因此无法确保它们在每个生产批次中的行为。
[0008]尽管在新的生物墨水及其生物印刷技术的开发方面已取得了巨大的进步，但是仍然需要寻找能够满足合适的生物墨水的所有必要要求(例如良好的可印刷性和形状保真度)的新型生物材料。具体地，期望开发为细胞印刷提供保护环境的具有快速胶凝或固化能力的新生物材料，以及可以以低浓度使用、产生合适的生物力学性能和高孔隙率的生物材料。
[0009]专利技术概述
[0010]本专利技术描述了新的ELR重组生物聚合物，其由具有天然弹性蛋白中存在的结构域的单体，除了包含称为“丝蛋白”的序列的单体和/或包含属于称为拉链蛋白的天然蛋白类别的称为HLF的序列的单体形成，它们是非毒性的，因此适合用作生物墨水。具体地，本专利技术涉及包含所述生物聚合物的组合物，并且主要用作3D打印的生物墨水。
[0011]基于ELR的生物材料已被证明在组织工程中具有巨大的潜力，这主要是因为它们具有非凡的生物相容性、生物降解性和可调节的机械性能。它们还可以产生多种自组装结构，例如胶束、纳米颗粒、水凝胶、膜或纳米纤维。如今，所述聚合物被广泛用于生物医学应用中，例如：基因疗法，疫苗释放系统，表面生物功能化以及作为组织工程应用中的水凝胶。ELR允许细胞生长和增殖，并且在生物系统中不诱导任何免疫反应，因此易于植入。在组织工程领域，这些材料已用于软骨和椎间盘、血管移植物以及眼和肝组织的再生。
[0012]由于它们是通过重组DNA技术生产的，因此可以设计ELR的氨基酸结构来调节它们的交联或自组装能力，其中它们可以自组装成物理和/或化学水凝胶。随后改善了机械性能，并且该性能将有利于将其用作3D生物打印机中的生物墨水。另外，其他功能可以通过融合其他蛋白质或包含生物活性结构域(例如细胞粘附基序(RGD、REDV等)、生长因子或金属蛋白酶)来在其序列中实现，从而有利于最终结构体的分解。
[0013]除生物学要求外，本专利技术中所述的ELR生物聚合物还具有可用于其用作生物墨水的用途的其他特性。这些材料显示出可用于3D生物打印的温度响应能力：由于聚合物在一定温度以上经历的快速构象变化，该聚合物能够在打印机墨盒中保持液态，并当它沉积在加热板上时迅速变为凝胶态。因此，它以液态和低粘度注射，减少了施加在针头上的应力，这有助于沉积并保护细胞免受可能的膜破裂。这种行为称为逆温度转变(ITT)，其特征在于转变温度Tt，取决于平均聚合物极性，可以通过改变ELR生物聚合物序列中存在的氨基酸组成来调节平均聚合物极性。因此，由于ITT性质，包含本文所述的生物聚合物的本专利技术的组合物从低于其Tt温度时的水合和无序状态转变为超过其Tt时的有序疏水折叠。这种独特性质的使用允许将所述组合本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.组合物，包括包含单体B、C、X和Y的生物聚合物，或至少两种分别包含单体B、C和X以及单体B、C和Y的生物聚合物，其中B是包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。C是包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，X是包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，并且Y是包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列。2.根据权利要求1的组合物，其中，所述生物聚合物还包含单体D，所述单体D是细胞结合氨基酸序列。3.根据权利要求2的组合物，其中，单体D包含选自以下的序列：RGD(SEQ ID NO：9)，LDT(SEQ ID NO：27)，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29。4.根据权利要求2至3中任一项的组合物，其中，单体D包含SEQ ID NO：6。5.根据权利要求1至4中任一项的组合物，其中，所述生物聚合物具有结构(I)：[(B
b
‑
C
c
)
‑
Z
z
]
n
‑
D
d
其中B、C和D在权利要求1
‑
4中定义，Z选自权利要求1中定义的单体X和/或Y，b的值介于5到15之间，c的值介于50到70之间；z的值介于1到5之间n的值介于1到5之间d的值介于0到3之间，并且其特征在于，所述组合物包含具有结构(I)的第一生物聚合物，其中Z为SEQ ID NO：4，以及具有结构(I)的第二生物聚合物，其中Z为SEQ ID NO：5。6.根据权利要求5的组合物，其中，所述第一生物聚合物在所述组合物中的存在浓度为40
‑
60重量％，并且所述第二生物聚合物在所述组合物中的存在浓度为60
‑
40重量％。7.根据权利要求1至4中任一项的组合物，其中，所述生物聚合物具有结构(II)：Z1
z
‑
[(B
b
‑
C
c
)
‑
Z2
z
]
n
‑
D
d
，其中B、C和D在权利要求1
‑
4中定义，Z1是分别包含SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5的氨基酸序列，Z2是分别包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：4的氨基酸序列；优选地，Z1是氨基酸序列SEQ ID NO：4，并且Z2是氨基酸序列SEQ ID NO：5；b、c、z、n和d在权利要求5中定义。8.根据权利要求5至7中任一项的组合物，其中b的值为10，c的值为60，z的值为1，n的值为2，d的值为0或1。9.根据权利要求2的组合物，其中，所述生物聚合物选自SEQ ID NO：16或选自SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：S，
申请(专利权)人：巴利亚多利德大学，
类型：发明
国别省市：