基于纳米抗体的微悬臂梁免疫传感方法技术

一种基于纳米抗体的微悬臂梁免疫传感方法，该微悬臂梁免疫传感方法包括：在微悬臂梁上修饰纳米抗体；在修饰有纳米抗体的微悬臂梁中加入缓冲液和待检测样品；待检测样品与修饰有纳米抗体的微悬臂梁反应后记录微悬臂梁的尖端位移；根据微悬臂梁的尖端位移确定待检测样品的浓度。本发明专利技术用纳米抗体替代整个抗体分子固定到微悬臂梁金表面上的方法，来达到提高微悬臂梁免疫传感灵敏度的目的；与已有的微悬臂梁免疫方法相比，纳米抗体作为最小的具有完整抗原结合位点的实体，大大提高了微悬臂梁表面的受体密度，并且可以定向固定，同时大大提高应力的传递效率。高应力的传递效率。高应力的传递效率。

【技术实现步骤摘要】
基于纳米抗体的微悬臂梁免疫传感方法


[0001]本专利技术涉及免疫传感检测领域，具体涉及一种基于纳米抗体的微悬臂梁免疫传感方法。

技术介绍

[0002]免疫传感技术的原理是基于检测抗原抗体的特异性配对反应，即针对需要检测的某种靶标分子(抗原)，通过生物免疫(把抗原注入小动物体内产生的)方法，产生出相应的探针分子(抗体)，提取、纯化出这种探针分子，再利用抗原抗体的特异性结合去检测样品中的靶分子。已有的免疫传感技术如：酶联免疫吸附试验(ELISA，原理是利用抗原与抗体的特异性反应与酶标的催化放大来进行)和免疫荧光法(IF，原理是用荧光片段标记抗原或抗体)，均需要标记物来示踪抗原抗体的反应结果，就是说仅有抗体，并不能建立相应的检测方法，还需要有酶标物或荧光标记物或蛋白复合物。而一些难制备的靶标分子的标记物价格昂贵，或几乎不可能制备或购买。同时酶联免疫试剂盒和蛋白芯片的检测从原理操作上都要求每一步反应完后进行清洗，标记过程繁琐耗时，是事后的检测，不能实时，原位、在线的检测。
[0003]基于表面应力检测的微悬臂梁免疫传感技术是近年出现的一种新的免疫生化传感方法，其原理是：把探针(抗原或抗体)分子用直接或间接的方式固定(修饰)到微悬臂梁一侧的镀金层上，当被检测样品液中的靶分子与微悬臂梁金表面上的探针分子发生免疫生化反应时，会使微悬臂梁表面应力改变，从而导致微悬臂梁弯曲变形，通过光学或电学方法检测这种变形的过程，可得到免疫生化反应的实时信息。基于免疫特异性识别建立的微悬臂梁免疫传感技术与传统的需要标记物的免疫传感方法相比，它无需使用任何酶标、荧光物质和放射性作为反应示踪剂，消除了标记过程的影响，灵敏度高(比酶联免疫试验高数倍)，还可以通过监测微悬臂梁变形来实时、定量的监测抗原抗体的反应过程，得到更丰富的免疫生化反应的信息。经过这些年的发展，微悬臂梁传感被作为一种新兴技术，在生物工程和环境污染监测技术等方面与传统的方法进行对比研究，如RNA转录因子、酶、汞排放及挥发性化合物等，优于常规的酶联免疫方法。但即使如此，微悬臂梁免疫传感技术的检测灵敏度还不足以在成本方面获得相对于常规酶联免疫法的巨大优势，即如果微悬臂梁免疫传感技术的灵敏度或检测极限只比酶联免疫法高数倍，而微悬臂梁免疫传感技术的设备成本与酶联免疫相对较高，使得微悬臂梁免疫传感技术难以商业化。
[0004]影响微悬臂梁免疫传感器灵敏度的因素主要有三个方面：探针分子的灵敏度(与靶分子的亲和性)、探针分子的固定和微悬臂梁的设计与信号读出。由于微悬臂梁的规格与信号读出方式在微悬臂梁免疫传感器系统成型之后就无法改变，唯一可变的是探针分子。一种合适的探针分子和修饰方法，能使固定在微悬臂梁表面的探针分子与样品溶液中的靶分子充分结合，并能高效地将结合所产生的应力变化传递到微悬臂梁表面。探针分子在微悬臂梁表面固定的方向性、密度、活性以及探针分子与微悬臂梁表面之间的联接分子的长度与刚性都有可能影响最终检测的灵敏度。
[0005]传统微悬臂梁检测中最常用的探针分子是传统抗体，目前，国内外文献报道的方法主要是利用具有双功能基团的疏基化试剂的疏基(
‑
SH)抓住微悬臂梁表面的金表面，和另一功能团抓住抗体，实现抗体在微悬臂梁镀金层上的固定。例如先将巯基化试剂11
‑
羧酸硫醇结合到微悬臂梁的金表面，活化其上的羧基，使之与抗体上的氨基结合来固定抗体。或用一种巯基化试剂盐酸硫醇亚胺，通过与抗体反应，使抗体连接一个带巯基的分子基团，再通过这个巯基将抗体联结到微悬臂梁的金表面上。这些方法固定抗体，存在如下共同的问题：(1)Y字形抗体的Fc段或Fab段的顶端部，会等概率的被固定在金表面上，没有方向性。而当Fab段的顶端被固定在金表面上时，结合位点被遮挡，限制了抗体的抗原结合位点与抗原的充分结合，从而降低了微悬臂梁传感灵敏度；(2)抗体与微悬臂梁之间存在不同数目C原子的单链分子，降低了抗原抗体反应产生的应力传递到梁上的效率。同时这些化学处理会影响抗体的活性从而影响其与抗原的结合，此外，受限于抗体大的分子尺寸，微悬臂梁表面固定的数量有限，这些因素的共同作用下使得微悬臂梁表面能有效结合抗原的位点的数量很少。当靶分子抗原浓度比较低的时候，与抗体间特异性结合造成的偏转就会被非特异性相互作用的噪声所淹没，所以难以实现对靶分子的高灵敏和超灵敏检测。同时传统抗体的制备需要先用抗原免疫动物，再利用杂交瘤技术并通过纯化获得，周期长，产量很低，价格昂贵，增加了微悬臂梁检测的成本和难度。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术的主要目的之一在于提出一种基于纳米抗体的微悬臂梁免疫传感方法，以期至少部分地解决上述技术问题中的至少之一。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术提供了一种基于纳米抗体的微悬臂梁免疫传感方法，包括：
[0008]在微悬臂梁上修饰纳米抗体；
[0009]在修饰有纳米抗体的微悬臂梁中加入缓冲液和待检测样品；
[0010]待检测样品与修饰有纳米抗体的微悬臂梁反应后记录微悬臂梁的尖端位移；
[0011]根据微悬臂梁的尖端位移确定待检测样品的浓度。
[0012]基于上述技术方案可知，本专利技术的基于纳米抗体的微悬臂梁免疫传感方法相对于现有技术至少具有以下优势之一或一部分：
[0013]1)本专利技术用纳米抗体替代整个抗体分子固定到微悬臂梁金表面上的方法，来达到提高微悬臂梁免疫传感灵敏度的目的；与已有的微悬臂梁免疫方法相比，纳米抗体作为最小的具有完整抗原结合位点的实体，大大提高了微悬臂梁表面的受体密度；
[0014]2)同时由于纳米抗体的可编辑性，可通过蛋白质工程在远离抗原结合位点的C端加上一个半胱氨酸，从而可以通过S
‑
Au共价键一步固定到微悬臂梁金表面，在实现定向固定，暴露出更多有效抗原结合位点的同时，大大简化了实验的准备过程，减少了时间，降低了技术培训的门槛；
[0015]3)纳米抗体较小的尺寸可以显著减小抗原结合区域到梁表面的距离，从而大大提高了应力的传递效率；这几个因素的结合，同时纳米抗体本身的亲和力不逊于传统抗体，从而可以大大提高微悬臂梁免疫传感的灵敏度，在针对癌胚抗原(CEA)的检测中，纳米抗体功能化的微悬臂梁相比传统抗体的检测极限降低了500倍；
[0016]4)纳米抗体具有很好的热稳定性，耐酸耐碱，这样提高了微悬臂梁检测结果的稳定性和重现性，同时芯片的重复利用能力相比传统抗体功能化的微悬臂梁有了显著提升，在我们的实验中经过氢氧化钠处理的微悬臂梁仍有80％左右的偏转响应；
[0017]5)纳米抗体可以通过蛋白质工程大量生产，成本得以大大降低，周期和稳定性也得以提升；而传统抗体需要对动物进行免疫，周期长，成功率低，成本高，这些都不利于微悬臂梁技术的大规模推广；
[0018]6)纳米抗体的小尺寸结构在针对一些特殊的蛋白结构，如口袋，仍旧可以免疫，但是传统抗体无法对口袋内的特异结构进行免疫，所以无法对这类特殊蛋白就行免疫，无法获得合适的靶分子，应用范围有局限性。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于纳米抗体的微悬臂梁免疫传感方法，包括：在微悬臂梁上修饰纳米抗体；在修饰有纳米抗体的微悬臂梁中加入缓冲液和待检测样品；待检测样品与修饰有纳米抗体的微悬臂梁反应后记录微悬臂梁的尖端位移；根据微悬臂梁的尖端位移确定待检测样品的浓度。2.根据权利要求1所述的微悬臂梁免疫传感方法，其特征在于，所述纳米抗体包括anti
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CEA Nb、anti
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HER2 Nb、anti
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PSA Nb、anti
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AFP Nb、anti
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AFB1 Nb、anti
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ATP Nb中的任一种。3.根据权利要求1所述的微悬臂梁免疫传感方法，其特征在于，所述修饰有纳米抗体的微悬臂梁中纳米抗体的浓度为2至10μg/mL。4.根据权利要求1所述的微悬臂梁免疫传感方法，其特征在于，所述待检测样品包括CEA溶液、HER2溶液、PSA溶液、AFP溶液、AFB1溶液、ATP溶液、血清、尿液、组织中的任一种。5.根据权利要求1所述的微悬臂梁免疫传感方法，其特征在于，所述待检...

【专利技术属性】
技术研发人员：张青川，饶得鹏，吴尚犬，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：