LipR蛋白及其编码基因在调控DHA和油脂合成中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种与二十二碳六烯酸(DHA)和油脂代谢调控有关的转录调控因子LipR及其编码基因与应用。本发明专利技术还提供了利用LipR及其编码基因在微生物中提高DHA和油脂产量的方法。法。

【技术实现步骤摘要】
LipR蛋白及其编码基因在调控DHA和油脂合成中的应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及脂肪酸的生物合成领域。

技术介绍

[0002]二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA)是一种ω
‑
3多不饱和脂肪酸。DHA作为大脑灰质的主要成分，对于胎儿大脑形成以及婴幼儿智力发育至关重要，还具有促进婴幼儿神经系统和视觉系统的发育、预防心血管疾病、抗癌、抗抑郁和预防和改善老人痴呆等多种功效。
[0003]破囊壶菌科(Thraustochytrids)真菌的胞内油脂可占生物量的40～50％以上，其中，DHA在总油脂中高达35％～45％。破囊壶菌科真菌具有可进行高密度发酵，生物量大和培养周期短的优点，因此，是非常理想的DHA的来源生物。
[0004]产油微生物的油脂生物合成也受到微生物细胞内的多重调控，例如，转录调控因子通过感知环境中的碳氮源信号等直接或间接调控脂肪酸合成基因的表达。
[0005]尽管为提高微生物中DHA的产量，研究者们在菌种选育、培养基优化和改进发酵工艺等方面进行了许多研究，但是微生物中DHA的产量仍然不理想，依然对提高微生物合成DHA的产量，尤其是通过调控因子调控微生物细胞内DHA的表达存在着迫切的需求。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供了转录调控因子LipR及其编码基因，以及所述LipR及其编码基因在调控DHA和油脂合成中的应用。本专利技术还涉及用于调节LipR表达的物质或方法在调控DHA和油脂合成中的应用。进一步地，本专利技术涉及利用LipR及其编码基因和/或用于调节LipR表达的物质或方法合成DHA和油脂的方法。
[0007]第一方面，本专利技术涉及分离的LipR蛋白，所述LipR蛋白选自：
[0008](1)一种蛋白，所述蛋白与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性，并且具有LipR蛋白的活性；
[0009](2)一种蛋白，所述蛋白由一种多核苷酸编码，所述多核苷酸在严格条件下与SEQ ID NO:1的编码序列或其互补序列杂交，并且具有LipR蛋白的活性；
[0010](3)一种蛋白，所述蛋白由一种多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的编码多核苷酸序列具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性，并且具有LipR蛋白的活性；
[0011](4)(1)，(2)或(3)的蛋白的一种变体，所述变体在一个或多个位置处包括一个或多个取代、缺失和/或插入，并且具有LipR蛋白的活性。
[0012]第二方面，本专利技术提供了编码第一方面的分离的LipR蛋白的多核苷酸。
[0013]第三方面，本专利技术提供了用于提高微生物中油脂含量的方法，所述方法包括使微生物基因组中的lipR基因表达下调或表达降低的步骤。
[0014]所述lipR基因表达下调可以是lipR基因被敲除、失活、缺失、阻断、敲低或者表达受到抑制，使得所述微生物下调表达LipR蛋白或不表达LipR蛋白。
[0015]在一些实施方式中，所述lipR基因表达下调可以基于同源重组的基因打靶方法实现，也可通过CRISPR系统或其它任何基因敲除或阻断的方法实现，也可通过RNAi的手段敲低所述基因的表达实现。
[0016]在一些实施方案中，通过双载体法的同源重组实现lipR基因表达下调，具体是通过PCR分别扩增所述基因的上下游片段，分别连接在抗性基因上，然后共转化所述微生物实现。
[0017]在一些实施方案中，所述微生物为产油微生物，例如，破囊壶菌科真菌。优选地，所述破囊壶菌科真菌为裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)，破囊壶菌(Thraustochytrium sp.),Aurantiochytrium sp.，Hondaea sp.,Ulkenia sp.，Monorhizochytrium sp.，或Aplanochytrium sp.。更优选地，所述破囊壶菌科真菌为裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)。
[0018]在一些实施方案中，所述油脂为一种或者多种多不饱和脂肪酸(PUFA)和/或饱和脂肪酸。优选地，所述一种或者多种PUFA例如为二十二碳六烯酸(“DHA”)，二十二碳五烯酸(“DPA”)和/或二十碳三烯酸。所述饱和脂肪酸例如为棕榈酸(“PA”)，花生酸(“Ad”)和/或山俞酸。
[0019]优选地，所述微生物为裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)，所述油脂为DHA。更优选地，所述微生物为裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)，所述油脂为DHA。
[0020]微生物基因组中的lipR基因表达下调还可以上调脂肪酸合成酶基因的转录。所述脂肪酸合成酶包括但不限于pfa1、pfa2、pfa3和fas。fas基因属于饱和脂肪酸合成酶基因。pfa1、pfa2和pfa3基因属于不饱和脂肪酸合成酶基因。
[0021]本申请中，lipR基因敲除突变株中pfa1、pfa2、pfa3和fas基因的转录水平明显上调，其中饱和脂肪酸合成酶基因fas基因上调了6倍以上，而长链不饱和脂肪酸合成酶基因pfa1、pfa2和pfa3均上调了12倍以上。这与lipR基因敲除突变株中DHA产量增长比例高于总油脂增长比例相一致，表明LipR蛋白通过负调控pfa1、pfa2、pfa3和fas基因的转录影响裂殖壶菌的DHA和其他油脂的合成，而且对DHA的合成有更显著的调控作用。
[0022]第四方面，本专利技术提供了构建油脂含量提高的微生物的方法，所述方法包括使微生物基因组中的lipR基因表达下调或表达降低。
[0023]所述lipR基因表达下调可以是lipR基因被敲除、失活、缺失、阻断、敲低或者表达受到抑制，使得所述微生物下调表达LipR蛋白或不表达LipR蛋白。
[0024]在一些实施方式中，所述lipR基因表达下调可以基于同源重组的基因打靶方法实现，也可通过CRISPR系统或其它任何基因敲除或阻断的方法实现，也可通过RNAi的手段敲低所述基因的表达实现。
[0025]在一些实施方案中，通过双载体法的同源重组实现lipR基因表达下调，具体是通过PCR分别扩增所述基因的上下游片段，分别连接在抗性基因上，然后共转化所述微生物实现。
[0026]在一些实施方案中，所述微生物为产油微生物，例如，破囊壶菌科真菌。优选地，所述破囊壶菌科真菌为裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)，破囊壶菌(Thraustochytrium sp.),Aurantiochytrium sp.，Hondaea sp.,Ulkenia sp.，Monorhizochytrium sp.，或
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.分离的LipR蛋白，所述LipR蛋白选自：(1)一种蛋白，所述蛋白与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性，并且具有LipR蛋白的活性；(2)一种蛋白，所述蛋白由一种多核苷酸编码，所述多核苷酸在严格条件下与SEQ ID NO:1的编码序列或其互补序列杂交，并且具有LipR蛋白的活性；(3)一种蛋白，所述蛋白由一种多核苷酸编码，所述多核苷酸与SEQ ID NO:1的编码多核苷酸序列具有至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性，并且具有LipR蛋白的活性；以及(4)(1)，(2)或(3)的蛋白的一种变体，所述变体在一个或多个位置处包括一个或多个取代、缺失和/或插入，并且具有LipR蛋白的活性。2.编码权利要求1的分离的LipR蛋白的多核苷酸。3.用于提高微生物中油脂含量的方法或构建油脂含量提高的微生物的方法，其特征在于，所述方法包括使微生物基因组中的lipR基因表达下调或表达降低的步骤，优选地所述lipR基因表达下调或表达降低为lipR基因敲除、失活、缺失、阻断、敲低或者表达受到抑制；更优选地，所述lipR基因表达下调是基于同源重组的基因打靶方法实现，或通过CRISPR系统基因敲除或阻断的方法实现，或通过RNAi敲低所述基因的表达实现；更优选地，通过双载体法的同源重组实现lipR基因表达下调。4.根据权利要求3的方法，其特征在于，所述微生物为产油微生物，优选地，为破囊壶菌科真菌，优选地，所述破囊壶菌科真菌为裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)，破囊壶菌(Thraustochytrium sp.),Aurantiochytrium sp.，Hondaea sp.,Ulkenia sp.，Monorhizochytrium sp.，或Aplanochytrium sp.，更优选地，所述破囊壶菌科真菌为裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)。5.根据权利要求3的方法，其特征在于，所述油脂为一种或者多种多不饱和脂肪酸和/或...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈芝，韩笑，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：