血流感染患者血液样本处理方法技术

本发明专利技术涉及一种血流感染患者血液样本处理方法，包括以下步骤：采集患者血液样本到血培养瓶中，将血培养瓶置于血培养仪中孵育至少5小时；取孵育后血培养瓶中的含菌血液到血清分离胶促凝管中，离心分离，弃去上清液，然后向血清分离胶促凝管中加入无菌水，震荡后形成菌悬液；将菌悬液转移至离心管中，向离心管中加入十二烷基硫酸钠裂解液，震荡，离心分离，弃去上清，得到沉淀物；向沉淀物中加入缓冲液Tris

【技术实现步骤摘要】
血流感染患者血液样本处理方法


[0001]本专利技术涉及一种对血流感染患者血液样本中的病原体进行增菌、富集和去除PCR抑制物的方法，属于生物


技术介绍

[0002]血流感染(bloodstream infection)是一种在住院患者中很常见的一种危重症，它发病率很高，全球每年发生超过180万例重症血流感染，根据我国多中心流行病学调查显示，每年我国有约373万重症血流感染病例。并且，血流感染病情进展迅速，危重病人较多，病死率高。据国外流行病学调查显示，在重症监护病房，血流感染的病死率已经超过心肌梗死成为非心脏病人死亡的主要原因，若同时并发感染性休克，血流感染的病死率可高达80％。全球每天约14,000人死于血流感染及其并发症，中国的血流感染病死率也高达48.7％。
[0003]血流感染发病急、病程进展迅速、病死率很高，所以快速、准确的病原学诊断对血流感染防治及其重要，是采用积极、精准的抗菌治疗的依据，能够挽救血流感染患者生命。目前国内外血流感染病原菌检测的常规方法是血培养，它也是血流感染病原学鉴定的金标准。血培养的优点是特异性高，可以直接为临床提供明确的病原学检测结果，并可以进行后续的体外药敏试验，能够为临床选用特异的抗菌药物提供指导。但是采用血培养方法检测血流感染病原体尚存在一些问题，不能满足临床诊疗需求。第一，检出率低：国外报道的血培养阳性检出率大约为34.2％，国内血培养的阳性检出率也仅为21.4％。如果患者采样前使用过抗菌药物，或者未选择好适合的分离培养条件，将会导致假阴性率进一步升高；第二，耗时长：血培养检测时间较长，因为它需要有增菌过程，往往是数小时～数天，对于生长缓慢且培养条件苛刻的病原菌可能需要更长的时间。而且血培养报阳后还需要进行转种培养和生化鉴定，所以通常血培养的检测结果至少需要3个工作日；第三，污染率和假阳性率高：由于血培养采样高营养条件的增菌过程，所以在样本采集或培养过程中即使污染极少量的细菌，也会导致假阳性的发生，尤其是皮肤表面寄生的表皮葡萄球菌等凝固酶阴性葡萄球菌。
[0004]所以目前微生物实验室尝试采用分子生物学方法检测血流感染病原体。近年来，国内外部分实验室尝试采用聚合酶链式反应(PCR)、实时定量PCR(RT
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PCR)或多重PCR等方法，通过检测血流感染样本中病原体的特异性基因片段进行快速鉴定，PCR检测耗时短、灵敏度高，有望大大缩短检测时间、提高阳性检出率。但是这些以PCR为基础的方法用于检测血流感染样本中的病原体时也遇到一些问题：首先是血流感染患者血液中病原体浓度很低，通常<10CFU/mL，这个浓度显著低于PCR方法的检出下限，导致假阴性率较高；其次，如果首先对血液样本进行孵育增菌，然后再采用PCR防范进行检测，虽然病原体浓度可以得到提升，但是血培养瓶中的PCR抑制物又将会干扰PCR的检测，仍然导致阳性率很低。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种可以快速、准确的对血流感染患者全血标本中的病原体进行增菌、富集和去除PCR抑制物的血流感染患者血液样本处理方法。
[0006]本专利技术为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种血流感染患者血液样本处理方法，包括以下步骤：
[0007]A.采集患者血液样本到血培养瓶中，将血培养瓶置于血培养仪中孵育至少5小时；
[0008]B.取孵育后血培养瓶中的含菌血液到血清分离胶促凝管中，离心分离，弃去上清液，然后向血清分离胶促凝管中加入无菌水，震荡后形成菌悬液；
[0009]C.将菌悬液转移至离心管中，向离心管中加入十二烷基硫酸钠裂解液，震荡，离心分离，弃去上清，得到沉淀物；
[0010]D.向沉淀物中加入缓冲液Tris
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Hcl进行洗涤，离心分离后得到所需病原体。
[0011]上述步骤A中的孵育时间为5～8小时。在对血液样本进行孵育时，优选的孵育时间是5小时，该时间经过试验论证是使血培养瓶中的各种细菌和真菌能够增菌至更高的浓度的最短时间。
[0012]上述步骤B中含菌血液的用量为5～10mL。
[0013]上述步骤B中的离心分离条件是900g离心10～12分钟。
[0014]上述步骤C中的离心分离条件是15800g离心2～3分钟。
[0015]上述步骤D中的离心分离条件是15800g离心2～3分钟。
[0016]上述缓冲液Tris
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Hcl的pH值的范围是7.4～8.8。
[0017]上述十二烷基硫酸钠裂解液浓度为10％，加入十二烷基硫酸钠裂解液的体积用量是含菌血液体积用量的15％～25％。采用浓度为10％的十二烷基硫酸钠裂解各种蛋白质类抑制物，同时又能保存核酸结构的完整。
[0018]上述步骤C中加入十二烷基硫酸钠裂解液后震荡10～20秒。
[0019]本专利技术具有积极的效果：
[0020](1)本专利技术的血流感染患者血液样本处理方法基于病原体孵育、分离胶离心富集和化学法裂解灭活PCR抑制物的原理对血流感染患者全血标本中的病原体进行快速增菌、富集和去除PCR抑制物的方法，将血液样本在血培养瓶中孵育一定时间，可使革兰阳性细菌、革兰阴性细菌和真菌等病原体生长、繁殖传代，达到增菌的目的。不同于传统采用基本差速离心的模式，而是将孵育完成的血培养样本置于血清分离胶促凝管中离心，可将血细胞、培养基质液和病原体通过一次离心就分离开，既减少了非特异性物质对后续检测的干扰，又达到了富集病原体的目的。采用了十二烷基硫酸钠(SDS)化学灭活PCR抑制物的步骤，可使富集完成的病原体中顽固存在的PCR抑制物灭活去除，同时不对病原体核酸造成影响，为后续基于核酸检测的分子生物学鉴定奠定基础。采用Tris
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Hcl对已经去除PCR抑制物的病原体富集物进行洗涤，排除了可能干扰后续检测的杂质。
[0021](2)本专利技术的血流感染患者血液样本处理方法可以在最快5.5小时内完成对患者全血样本中病原体的增菌、富集和PCR抑制物去除。该方法采用的均为临床微生物实验室常见仪器、试剂，能对血流感染患者血液样本进行处理，为后续PCR等分子生物学检测方法提供富集、纯化的病原体，实现血流感染病原体的快速诊断。有利于帮助临床医师在及时明确病原体种类并采取有效治疗方案，同时减少经验性抗生素使用，降低医疗成本。本专利技术的方
法可以有效的为分子生物学方法诊断血流感染打通了最后一个障碍，有助于在第一时间内明确性感染的病原体种类，采取正确的治疗方案，防止感染加剧和减少耐药菌株的产生。
附图说明
[0022]图1是患者血液样本用本专利技术实施例1的方法处理后采用本专利技术试剂盒进行PCR反应后进行毛细管电泳分析后的图谱；
[0023]图2是患者血液样本用常规方法培养5个小时后采用本专利技术试剂盒进行PCR反应后进行毛细管电泳分析后的图谱；
[0024]图3是本专利技术试剂盒对混合阳性对照进行PCR反应后进行毛细管电泳分析后的图谱；
[0025本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种血流感染患者血液样本处理方法，其特征在于，包括以下步骤：A．采集患者血液样本到血培养瓶中，将血培养瓶置于血培养仪中孵育至少5小时；B．取孵育后血培养瓶中的含菌血液到血清分离胶促凝管中，离心分离，弃去上清液，然后向血清分离胶促凝管中加入无菌水，震荡后形成菌悬液；C．将菌悬液转移至离心管中，向离心管中加入十二烷基硫酸钠裂解液，震荡，离心分离，弃去上清，得到沉淀物；D．向沉淀物中加入缓冲液Tris
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Hcl进行洗涤，离心分离后得到所需病原体。2.根据权利要求1所述的血流感染患者血液样本处理方法，其特征在于：所述步骤A中的孵育时间为5～8小时。3.根据权利要求1所述的血流感染患者血液样本处理方法，其特征在于：所述步骤B中含菌血液的用量为5～10mL。4.根据权利要求1所述的血流感染患者血液样本处理方法，其特征在于：所述步骤B...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵虎，张艳梅，张景皓，杨峰，
申请(专利权)人：华东医院，
类型：发明
国别省市：