LPMO裂解纤维素酶活的测定方法和检测试剂盒技术

本发明专利技术公开一种LPMO裂解纤维素酶活的测定方法和检测试剂盒，其中，该LPMO裂解纤维素酶活的测定方法包括以下步骤：将抗坏血酸、纤维素和LPMO在49～51℃下孵育25～35min；加入抗坏血酸氧化酶终止反应；离心取上清液，加入显色液25℃～28℃孵育5～30min，所述显色液包含SsGOOX、HRP、4

【技术实现步骤摘要】
LPMO裂解纤维素酶活的测定方法和检测试剂盒


[0001]本专利技术涉及生物工程
，特别涉及一种LPMO裂解纤维素酶活的测定方法和检测试剂盒。

技术介绍

[0002]裂解多糖单加氧酶(Lytic Polysaccharide Monooxygenase，LPMO)是由细菌、真菌乃至昆虫等产生的一大类酶，它们可对糖苷键进化氧化裂解。其中，辅助活性家族9(AA9家族)LPMO可直接对结晶纤维素进行氧化裂解，破坏其结晶结构，使之更容易被纤维素酶水解。LPMO以铜离子为辅基，在外源电子供体及氧气的参与下可将结晶纤维素中的β
‑
1,4
‑
糖苷键氧化裂解。
[0003]LPMO在真菌中普遍存在，种类繁多。建立高通量的活性分析方法，从中筛选出性能优良的品种，将有利于促进LPMO在二代生物炼制技术中的应用。但是，现有的测定方法，例如高效阴离子色谱技术、液相色谱质谱联用技术、糖凝胶电泳测定方法、采用标记底物测定方法、比色定量方法等，测定的过程繁琐，成本高昂，且准确性不高。
[0004]上述内容仅用于辅助理解专利技术的技术方案，并不代表承认上述内容是现有技术。

技术实现思路

[0005]本专利技术的主要目的是提出一种LPMO裂解纤维素酶活的测定方法，旨在解决现有技术测定LPMO裂解纤维素酶活的过程繁琐、成本高和准确性不高的技术问题。
[0006]为实现上述目的，第一方面，本专利技术提出一种LPMO裂解纤维素酶活的测定方法，包括以下步骤：
[0007]S1、将抗坏血酸、纤维素和LPMO在49～51℃下孵育25～35min；
[0008]S2、加入抗坏血酸氧化酶终止反应；
[0009]S3、离心取上清液，加入显色液25℃～28℃孵育5～30min，所述显色液包含SsGOOX、HRP、4
‑
AAP和DHBS；
[0010]S4、测量溶液的吸光值，检测波长为515nm，通过吸光值得到单位时间内释放的还原糖的浓度，进而得到LPMO的测量酶活力。
[0011]可选地，所述LPMO包含C1型LPMO，所述C1型LPMO的实际酶活力为测量计算得到的酶活乘以校正系数4.75。
[0012]可选地，所述抗坏血酸的浓度大于或等于0.9mmol/L，且小于或等于1.2mmol/L。
[0013]可选地，所述抗坏血酸氧化酶的酶活大于或等于1U，且小于或等于5U。
[0014]可选地，所述SsGOOX的浓度大于或等于90nmol/L，且小于或等于110nmol/L。
[0015]可选地，所述HRP的酶活力大于或等于5U，且小于或等于10U。
[0016]可选地，所述4
‑
AAP的浓度大于或等于0.08mmol/L，且小于或等于0.4mmol/L。
[0017]可选地，所述DHBS的浓度大于或等于1.5mmol/L，且小于或等于4mmol/L。
[0018]第二方面，本专利技术还提出一种LPMO裂解纤维素酶活的检测试剂盒，包括：
[0019]抗坏血酸，浓度为0.9～1.2mmol/L；
[0020]抗坏血酸氧化酶，酶活为1U～5U；
[0021]SsGOOX，浓度为90～110nmol/L；
[0022]HRP，酶活为5U～10U；
[0023]4‑
AAP，浓度为0.08～0.4mmol/L；
[0024]DHBS，浓度为1.5～4mmol/L；以及
[0025]pH缓冲液，pH值为7.0～7.2。
[0026]本专利技术LPMO裂解纤维素酶活的测定方法包括：将抗坏血酸、纤维素和LPMO在49～51℃下孵育25～35min；加入抗坏血酸氧化酶终止反应；离心取上清液，加入显色液25℃～28℃孵育5～30min，所述显色液包含SsGOOX、HRP、4
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AAP和DHBS；如此，所述抗坏血酸为所述LPMO裂解纤维素提供电子，所述LPMO将纤维素氧化裂解成还原糖；所述抗坏血酸氧化酶消除反应液中的所述抗坏血酸，终止所述LPMO裂解纤维素的反应，消除所述抗坏血酸对基于Trinder测定的干扰；所述SsGOOX对可溶性的所述还原糖进行裂解，产生过氧化氢；在所述HRP的存在下，所述过氧化氢与色源物质所述4
‑
AAP和所述DHBS发生所述Trinder反应，将所述4
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AAP和所述DHBS转化为红色的醌亚胺染料；通过酶标仪检测所述红色醌亚胺染料的吸光度值，根据获得的吸光度值，使用标准的纤维二糖溶液，计算单位时间内所述LPMO释放的可溶性还原糖的浓度，从而得到所述LPMO裂解纤维素的酶活。这样，本专利技术LPMO裂解纤维素酶活的测定方法针对所述LPMO的糖苷氧化裂解活性而开发，检测时间短，不需要使用昂贵的检测仪器，且更加准确地表征了所述LPMO裂解纤维素的酶活。
附图说明
[0027]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
[0028]图1为实施例1中琼脂糖凝胶电泳结果图；
[0029]图2为实施例2中变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白免疫印迹结果图；
[0030]图3为实施例3中温度和pH值对SsGOOX酶活影响的结果图；
[0031]图4为实施例3中动力学参数公式；
[0032]图5为实施例3中SsGOOX的热稳定性结果；
[0033]图6为实施例4中4
‑
AAP和DHBS的浓度对还原糖检测能力的影响；
[0034]图7为实施例5中还原糖浓度和检测时间的测定结果图；
[0035]图8为实施例6中抗坏血酸氧化酶消除残留抗坏血酸对显色物质形成影响的结果图；
[0036]图9为实施例7中LPMO裂解纤维素酶活的测定结果图；
[0037]图10为实施例8中酶活力及比活力的测定结果图。
[0038]本专利技术目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
[0039]需要说明，若本专利技术实施例中有涉及“第一”、“第二”等的描述，则该“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，全文中出现的“和/或”的含义为，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案，或B方案，或A和B同时满足的方案。
[0040]本专利技术提出一种LPMO裂解纤维素酶活的测定方法，包括以下步骤：将抗坏血酸、纤维素和LPMO在49～51℃下孵育25～35min；加入抗坏血酸氧化酶终止反应；离心取上清液，加入显色液2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种LPMO裂解纤维素酶活的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将抗坏血酸、纤维素和LPMO在49～51℃下孵育25～35min；S2、加入抗坏血酸氧化酶终止反应；S3、离心取上清液，加入显色液25℃～28℃孵育5～30min，所述显色液包含SsGOOX、HRP、4
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AAP和DHBS；S4、测量溶液的吸光值，检测波长为515nm，通过吸光值得到单位时间内释放的还原糖的浓度，进而得到LPMO的酶活。2.如权利要求1所述的LPMO裂解纤维素酶活的测定方法，其特征在于，所述LPMO包含C1型LPMO，所述C1型LPMO的实际酶活力为测量计算得到的酶活乘以校正系数4.75。3.如权利要求1所述的LPMO裂解纤维素酶活的测定方法，其特征在于，所述抗坏血酸的浓度大于或等于0.9mmol/L，且小于或等于1.2mmol/L。4.如权利要求1所述的LPMO裂解纤维素酶活的测定方法，其特征在于，所述抗坏血酸氧化酶的酶活大于或等于1U，且小于或等于5U。5.如权利要求1所述的LPMO裂解纤维素酶活的测...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘刚，吴帅帅，田娟，王娟，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：